同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法与流程

1.本发明涉及检测技术领域，具体涉及一种1-9同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法。

背景技术：

2.泌尿系结石(nephrolithiasis)是一种常见病和高发病。目前，泌尿系结石在我国的患病率为5％-10％，且5年复发率高达70％-80％。泌尿系结石的发病可引起尿路感染、腰腹疼痛、肾积水、肾功能衰竭等，同时反复的药物及手术对患者带来了巨大的经济及生活负担。目前，临床上对于泌尿系结石的诊断和，已有成熟的方案。然而，如何有效降低泌尿系结石复发，仍是临床上的一大难题。
3.24小时尿液代谢评估是目前国内外泌尿外科指南推荐的，应用于复杂性结石的患者(复发性结石、存在肾内残留结石和具有危险因素的结石患者)，为其提供系统全面代谢评估，从而制定有效的预防结石复发的方案。24小时尿液评估是指通过收集泌尿系结石患者24小时内全部尿液，检测患者24小时尿液中草酸、枸橼酸、胱氨酸、尿酸、肌酐、钙、磷、钾等关键代谢物的水平。
4.在24小时尿液检测指标中，草酸、枸橼酸及胱氨酸是重要的代谢指标。草酸钙(caox)是最常见的结石成分，约占泌尿系结石的80％以上。尿草酸易与尿液中的钙离子形成caox，因此尿草酸水平在肾结石形成中发挥着重要作用。另一方面，枸橼酸是预防肾结石形成的重要保护因素，可从多个机制预防肾结石的形成。枸橼酸可以与钙离子形成可溶性复合物，从而抑制尿中结晶的形成和钙盐的过饱和。低枸橼酸尿症是原发性肾结石患者的共同特征，尤其是含钙结石患者。胱氨酸结石是肾结石的一种特殊类型，多由于先天性遗传变异导致胱氨酸代谢异常，从而引起胱氨酸尿症，诱发难溶胱氨酸在尿液中沉积导致结石形成。由此可见，这3种代谢物的检测在泌尿系结石的代谢评估中占有重要的地位。但综合国内外文献及实验室检测报道，尚未有应用一种方法同时准确检测草酸、枸橼酸及胱氨酸的产品。
5.目前国内外报道，24小时尿液的代谢物检测中，草酸与枸橼酸大多采用离子谱仪检测或紫外分光光度仪酶法检测，而其余的钙、磷、钾、钠等物质主要采用自动生化仪进行检测。与以上方法相比，质谱检测被认为是一种更高阶、更准确的方法。通过质谱对24小时尿液中的草酸、枸橼酸和胱氨酸进行检测，不仅相对酶法和离子谱法更为精准。同时，考虑到草酸和枸橼酸具有稳定性差的化学特性，质谱检测方法相较酶法、离子谱法在操作流程中更为简便，也减少了处理过程中所带来的误差。
6.目前，国内外检测尿液中代谢物的方法，存在以下问题：
7.1.目前大部分的技术专利，未能实现对肾结石关键代谢物——草酸、枸橼酸和胱氨酸的同时精准检测，难以实现快速全面的24小时尿液代谢评估。
8.2.目前报道的尿液质谱检测草酸、枸橼酸的专利技术，所需的流程仍较为复杂，耗费时长较久，成本较高，难以实现大规模的自动化、市场化推进。
9.3.目前的检测技术专利尚未有明确针对24小时尿液代谢物的稳定性探究，尤其是加入不同防腐剂后对24小时尿液的草酸、枸橼酸等代谢物的影响。
10.因此，临床上，亟需开发一种方法简便、快速、重复性好，值得进一步推广的能同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法和产品。

技术实现要素：

11.本发明提供了一种同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，旨在解决上述背景技术中存在的问题。
12.为了实现上述技术目的，本发明主要采用如下技术方案：
13.一种同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，包括如下步骤：
14.s1供试品的制备：取24h待测尿液样品，加入草酸-1,2-13
c2作为草酸的内标，柠檬酸-2,2,4,4-d4作为柠檬酸的内标，l-胱氨酸-d4作为胱氨酸的内标；进行衍生化处理后，再依次加入四甲基氟化铵溶液和乙腈溶液，混匀后上弱阳离子交换96孔板，收集洗脱液，作为供试品；
15.s2检测：利用液相谱串联质谱仪进行供试品检测。
16.其中，本发明的步骤s1中，所述衍生化处理包括如下步骤：向加有内标工作液的24h待测尿液样品中依次加入苯甲醇和三甲基氯硅烷，涡旋震荡混匀后，放入烘箱中，80℃条件下进行衍生化。
17.优选的，所述内标溶液中，草酸-1,2-13
c2的浓度为25μg/ml，檬酸-2,2,4,4-d4的浓度为10μg/ml，l-胱氨酸-d4的浓度为12.5μg/ml。
18.本发明的步骤s2中，液相谱的检测条件为：
19.液相谱系统高压泵a流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-水溶液；
20.液相谱系统高压泵b流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-甲醇溶液；
21.梯度洗脱程序为：
22.时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.0060400.5060401.0025752.6025752.7001003.4001003.5060404.006040
23.进一步的，谱条件中，谱柱为phenomenex f5 column,2.6μm,100a,3.0
×
50mm，流动相流速为0.6ml/min。
24.更进一步的，谱条件中，柱温为40℃，进样量为5μl。
25.此外，本发明的步骤s2中，质谱条件为：采用电喷雾电离源，正离子模式，喷雾电压：5500v；温度：500℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi；气帘气：25psi；cad：9；具体监测的离子对以及碰撞能量如下：
[0026][0027][0028]
作为本发明的其中一个较佳的实施例，本发明的检测方法还包括采用稳定同位素标记的草酸-1,2-13
c2作为草酸的内标，柠檬酸-2,2,4,4-d4作为柠檬酸的内标，l-胱氨酸-d4作为胱氨酸的内标；通过制备一系列不同浓度的标准品，制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x”权重得回归方程；将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算尿液样品中各待测成分的浓度。
[0029]
作为本发明的另一个较佳的实施例，本发明的检测方法还包括测定人工基质中草酸、柠檬酸和胱氨酸的本底值，然后再向人工基质中加入已知浓度的草酸、柠檬酸和胱氨
酸，通过液相谱串联质谱仪进行检测，将实际测得的草酸、柠檬酸和胱氨酸与理论计算得到的草酸、柠檬酸和胱氨酸进行比较，判断液相谱串联质谱仪检测方法的可靠性。
[0030]
本发明的另一个目的是提供一种试剂盒在泌尿系结石患者尿液代谢评估中的应用，所述试剂盒中包含有草酸、柠檬酸和胱氨酸组成的标志组合物，所述标志组合物采用上述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法进行检测。
[0031]
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
[0032]
(1)本发明通过对先对尿液中的有机酸进行衍生化，然后再进行检测的方法相较于直接检测，虽然耗时长，但方法的稳健度更高，检测更准确。同时，衍生化反应使得化合物极性显著降低，更有助于分离柠檬酸-异柠檬酸等同分异构体，使得检测结果更准确。
[0033]
(2)本发明所用衍生化方法在有水环境中进行，对于尿液等富含水的生物样本来说，前处理过程更加便利，无需吹干即可反应，同时也降低了对外界环境湿度的要求，高湿度环境也不影响衍生效果，方法更稳健。
[0034]
(3)全程无需氮吹，无需换板，既能节约经济成本，又有利于后期实现自动化。
具体实施方式
[0035]
以下实施例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。实施例中未注明具体技术或条件者，按照本领域内的文献所描述的技术或条件，或者按照产品说明书进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者，均为可通过正规渠道商购买得到的常规产品。
[0036]
实施例一
[0037]
采用本发明的方法对24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸进行检测。
[0038]
1.1试剂的配制
[0039]
1.1.1标准溶液的制备
[0040]
1.1.1.1标准品储备液的制备，具体见表1
[0041]
表1标准品储备液的配制
[0042][0043]
1.1.1.2混合工作储备液(mix)的制备，具体见表2
[0044]
表2混合工作储备液(mix)的配制
[0045]
[0046]
注：1)在保证比例不变的前提下，可以适当调节体积。
[0047]
2)标准品储备液和混合储备液放置于-80℃冰箱。
[0048]
1.1.1.3配制标准曲线样品，具体浓度见表3。标准曲线样品分装后冷冻保存。
[0049]
表3各分析物的标准曲线浓度
[0050]
序号分析物标准曲线浓度(μg/ml)1草酸1，5，10，50，100，2002柠檬酸3，15，30，150，300，6003胱氨酸1，5，10，50，100，200
[0051]
1.1.2preparation of self-qc products自配质控品的制备
[0052]
1.1.2.1检测本底值：取人工尿基质，按照常规的检测流程测定基质中草酸、柠檬酸和胱氨酸的含量的本底值，将该份本底样本均分成3份，然后分别再向3份人工基质样本中分别添加不同量的但已知浓度的草酸、柠檬酸和胱氨酸，作为质控lqc、mqc和hqc，其中，lqc代表低浓度质控品；mqc代表中浓度质控品；hqc代表高浓度质控品。通过液相谱串联质谱仪进行检测，将实际测得的草酸、柠檬酸和胱氨酸与理论计算得到的质控lqc、mqc和hqc中的草酸、柠檬酸和胱氨酸分别进行比较，判断液相谱串联质谱仪检测方法的可靠性。
[0053]
其中，质控lqc、mqc和hqc的配置方法如表4所示。
[0054]
表4质控品的配制
[0055][0056]
根据表4配置的质控品的浓度如表5所示。
[0057]
表5质控品配制浓度
[0058][0059]
注：在保证比例不变的前提下，可以适当调节体积。
[0060]
1.1.3preparation of is solution内标溶液的配制
[0061]
1.1.3.1内标储备液的配制，具体见表6
[0062]
表6内标储备液的配制
[0063][0064]
1.1.3.2内标工作液的配制，具体见表7
[0065]
表7内标工作液的配制
[0066][0067]
注：内标的储备液保存于-80℃冰箱，内标工作液保存于-20℃冰箱。
[0068]
1.1.4preparation of other solutions其他溶液的配制
[0069]
1.1.4.1 1n hcl溶液：取1ml浓盐酸至9ml水中，混匀。
[0070]
1.1.4.2pbs溶液：取1ml pbs(10
×
)溶液至9ml水中，混匀。
[0071]
1.1.4.3四甲基氟化铵溶液(0.3mm)：称取2.79mg四甲基氟化铵固体，溶于1ml异丙醇中，得到30mm四甲基氟化铵溶液母液，保存于-20℃冰箱。使用时取100μl母液溶于10ml异丙醇中(稀释100倍)，得0.3mm四甲基氟化铵溶液。
[0072]
1.2pretreatment前处理
[0073]
a)依次吸取20μl双空白(pbs溶液)、单空白(pbs溶液)、标准曲线、质控品和尿液样本，分别加入1.5ml已标记的ep管中；其中，双空白指不加标准品也不加内标，单空白指不加标准品但加内标；
[0074]
b)双空白样本中加入20μl 60％acn，其他样本中加入20μl内标工作液；
[0075]
c)向所有样本中加入50μl苯甲醇，再加入30μl三甲基氯硅烷，涡旋震荡2min；
[0076]
d)放入烘箱中，80℃衍生75min；
[0077]
e)取出后加入40μl四甲基氟化铵溶液，再加入200μl 80％乙腈溶液，涡旋震荡2min；
[0078]
f)取100μl处理后的溶液至96孔上样板中上样。
[0079]
1.3检测
[0080]
lc conditions液相谱条件
[0081]
液相谱系统高压泵a流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-水溶液
[0082]
液相谱系统高压泵b流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-甲醇溶液
[0083]
流速：0.6ml/min
[0084]
谱柱：phenomenex f5 column,2.6μm,100a,3.0
×
50mm
[0085]
柱温：40℃
[0086]
进样量：5μl
[0087]
梯度洗脱参数如下：
[0088]
时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.0060400.5060401.0025752.6025752.7001003.4001003.5060404.006040
[0089]
通过检测谱图得知：保留时间：柠檬酸：2.54min；草酸：1.99min；胱氨酸：1.36min
[0090]
1.4本发明再检测时，其联用的ms conditions质谱条件如下：
[0091]
电喷雾电离(esi)源，正离子模式；
[0092]
喷雾电压：5500v；
[0093]
温度：500℃；
[0094]
雾化气：55psi；
[0095]
辅助加热气：55psi；
[0096]
气帘气：25psi；
[0097]
cad：9
[0098]
多反应监测(mrm)扫描方式；
[0099]
离子对：
[0100][0101]
实施例二
[0102]
对实施例1的检测方法进行验证，其结果如下。
[0103]
2.1准确度和批内精密度
[0104][0105]
[0106][0107]
[0108][0109]
2.2批间精密度
[0110][0111]
[0112][0113]
[0114][0115]
2.3llmi
[0116][0117]
2.4线性
[0118][0119]
[0120][0121][0122]
结论：所有验证指标均通过。
[0123]
实施例三
[0124]
考察室温条件下样本添加不同防腐剂的稳定性
[0125]
1：不添加，1hcl：添加盐酸，1tl：添加甲苯，1du：添加重氮烷基脲；其他以此类推。
[0126][0127][0128]
草酸0h3h6h1day2day10day2weeks1100.00102.24106.57101.19101.49100.6089.551hcl100.00107.15101.87100.00101.09109.80106.69
1tl100.00111.57105.18105.94104.57107.15103.041du100.00108.49107.90106.4199.70109.84109.542100.00134.65152.45173.54186.25211.96203.012hcl100.0099.66101.57103.59105.16113.68112.332tl100.00114.00139.76168.33186.75209.96203.762du100.00121.79144.48168.37185.23202.10194.353100.00106.42104.99104.43105.27109.03107.093hcl100.00110.41107.08106.30111.95117.20117.663tl100.00102.55103.41102.72106.39106.57106.693du100.0097.6998.9299.85102.0098.48100.92
[0129]
胱氨酸0h3h6h1day2day10day2weeks1100.00105.21109.24110.66118.72121.56104.271hcl100.00105.58111.93105.33107.61137.31117.261tl100.00117.59122.36110.80125.88163.82138.691du100.00119.68111.97104.52101.33123.40111.442100.00101.21106.79102.56102.1190.8078.582hcl100.00110.02115.53109.18115.36132.05132.222tl100.00110.19112.35111.57114.66111.73101.702du100.00109.85111.38108.83103.57119.69110.533100.00116.40126.44118.22124.58150.87154.983hcl100.00113.76118.44109.74116.15123.09122.473tl100.00108.63112.94113.99112.71145.89144.763du100.00106.54107.0695.5699.51109.51105.84
[0130]
通过以上结果可知：在收集样本前加盐酸酸化24h尿液，样本中的草酸和柠檬酸可在室温下稳定放置2周。
[0131]
虽然，上文中已经用一般性说明及具体实施方案对本发明作了详尽的描述，但在本发明基础上，可以对之作一些修改或改进，这对本领域技术人员而言是显而易见的。因此，在不偏离本发明精神的基础上所做的这些修改或改进，均属于本发明要求保护的范围。

技术特征：

1.一种同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于，包括如下步骤：s1供试品的制备：取24h待测尿液样品，加入草酸-1,2-13
c2作为草酸的内标，柠檬酸-2,2,4,4-d4作为柠檬酸的内标，l-胱氨酸-d4作为胱氨酸的内标；进行衍生化处理后，再依次加入四甲基氟化铵溶液和乙腈溶液，混匀后上弱阳离子交换96孔板，收集洗脱液，作为供试品；s2检测：利用液相谱串联质谱仪进行供试品检测。2.根据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：步骤s1中，所述衍生化处理包括如下步骤：向加有内标工作液的24h待测尿液样品中依次加入苯甲醇和三甲基氯硅烷，涡旋震荡混匀后，放入烘箱中，80℃条件下进行衍生化。3.根据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：所述内标溶液中，草酸-1,2-13
c2的浓度为25μg/ml，檬酸-2,2,4,4-d4的浓度为10μg/ml，l-胱氨酸-d4的浓度为12.5μg/ml。4.根据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：步骤s2中，液相谱的检测条件为：液相谱系统高压泵a流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-水溶液；液相谱系统高压泵b流动相：0.1％甲酸-2mm乙酸铵-甲醇溶液；梯度洗脱程序为：时间(min)流动相a(％)流动相b(％)0.0060400.5060401.0025752.6025752.7001003.4001003.5060404.0060405.根据权利要求4所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：谱条件中，谱柱为phenomenex f5 column,2.6μm,100a,3.0
×
50mm，流动相流速为0.6ml/min。6.根据权利要求4所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：谱条件中，柱温为40℃，进样量为5μl。7.据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：步骤s2中，质谱条件为：采用电喷雾电离源，正离子模式，喷雾电压：5500v；温度：500℃；雾化气：55psi；辅助加热气：55psi；气帘气：25psi；cad：9；具体监测的离子对以及碰撞能量如下：
8.根据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在于：还包括采用稳定同位素标记的草酸-1,2-13
c2作为草酸的内标，柠檬酸-2,2,4,4-d4作为柠檬酸的内标，l-胱氨酸-d4作为胱氨酸的内标；通过制备一系列不同浓度的标准品，制作标准曲线，以标准溶液浓度为x轴，标准和内标峰面积的比值为y轴，进行线性回归分析，经“1/x”权重得回归方程；将样品中待测成分与其内标峰面积比代入标准曲线方程，计算尿液样品中各待测成分的浓度。9.根据权利要求1所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，其特征在
于：还包括测定人工基质中草酸、柠檬酸和胱氨酸的本底值，然后再向人工基质中加入已知浓度的草酸、柠檬酸和胱氨酸，通过液相谱串联质谱仪进行检测，将实际测得的草酸、柠檬酸和胱氨酸与理论计算得到的草酸、柠檬酸和胱氨酸进行比较，判断液相谱串联质谱仪检测方法的可靠性。10.一种试剂盒在泌尿系结石患者尿液代谢评估中的应用，其特征在于，所述试剂盒中包含有草酸、柠檬酸和胱氨酸组成的标志组合物，所述标志组合物采用如权利要求1-9任一项所述的同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法进行检测。

技术总结

本发明公开了一种同时检测24h尿液中草酸、柠檬酸和胱氨酸的方法，涉及检测技术领域。包括如下步骤：S1供试品的制备：取24h待测尿液样品，加入草酸-1,2-13C2作为草酸的内标，柠檬酸-2,2,4,4-d4作为柠檬酸的内标，L-胱氨酸-d4作为胱氨酸的内标；进行衍生化处理后，再依次加入四甲基氟化铵溶液和乙腈溶液，混匀后上弱阳离子交换96孔板，收集洗脱液，作为供试品；S2检测：利用液相谱串联质谱仪进行供试品检测。本发明的检测方法的稳健度更高，检测更准确，衍生化反应使得化合物极性显著降低，更有助于分离柠檬酸-异柠檬酸等同分异构体，同时，本发明所用衍生化方法在有水环境中进行，前处理过程更加便利，无需吹干即可反应，有利于后期实现自动化。期实现自动化。