李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜
【摘 要】To isolate efficient cellulase-producing bacteria, 180 bacterial isolated from rotten wood, humus, and other soil samples, and 44 were screened from them and confirmed as cellulase-producing bacteria by Gram's iodine solution staining. In the subsequent secondary screening tests, those 44 isolates were cultured in fermentation media and their total cellulase activities(FPase)were measured and compared. The strain J1-3-1, with the highest FPase activity, was identified as Sphingobacterium sp. by 16S rRNA sequence analysis. The optimal fermentation conditions for enzymes production of J1-3-1 were determined. Under the optimal conditions, its activities of FPase, CMCase, and β-glucosidase reached 8.76, 28.04和7.02 U/mL, respectively. The results demonstrated that J1-3-1 was a promising candidate for potential industrial production of cellulase.%以腐烂木材、腐殖土等材料作为菌源,从中分离出180个菌株,以期得到具有纤维素酶活性的菌株.采用革兰氏碘液染法进行定性初筛,获得了44个纤维素酶产生菌株.将此44个菌株发酵培养后,使用 滤纸酶活性测定法进行定量复筛,滤纸酶活性最高的是菌株J1-3-1.通过对J1-3-1菌株的16S rRNA的序列测定分析,将J1-3-1鉴定为鞘氨醇杆菌(Sphingobacterium sp.).经对J1-3-1进行产酶发酵条件优化,分别确立了产生最高滤纸酶(FPase)活性、内切葡聚糖酶(CMCase)活性和β-葡萄糖苷酶(β-glucosidase)活性的发酵条件.在最优发酵产酶条件下,菌株J1-3-1的滤纸酶、内切葡聚糖酶和β-葡萄糖苷酶的最高酶活性分别为8.76、28.04和7.02 U/mL.智能操作票
【期刊名称】《生物技术通报》
【年(卷),期】2015(031)005
【总页数】7页(P146-152)
nmda受体拮抗剂【关键词】纤维素酶产生菌;筛选;鉴定;发酵;鞘氨醇杆菌
【作 者】李争明;张娟;邓中洋;卢凡;秦文胜
板材矫直机【作者单位】湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室 工业发酵湖北省协同创新中心 河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学
院微藻实验室 工业发酵湖北省协同创新中心 河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室 工业发酵湖北省协同创新中心 河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;湖北工业大学资源与环境工程学院微藻实验室 工业发酵湖北省协同创新中心 河湖生态修复及藻类利用湖北省重点实验室,武汉 430068;Department of Biology,Lakehead University,Ontario,P7B 5E1,Canada
【正文语种】中 文
随着人口的膨胀和经济的迅猛发展，全球对能源的需求量大幅提升，其中化石燃料占能源消耗的85%以上［1，2］。如何满足世界对能源的需求、既实现经济的可持续性发展又能减轻化石燃料对环境的负面影响是目前世界各国关注的焦点。寻求来源丰富、可再生、低碳绿、经济适用的燃料来代替化石燃料是世界性研究热点［3-6］。木质纤维素是自然界最丰富、可再生的生物质资源，主要由纤维素、半纤维素、木质素等组成，结构和成分非常复杂，具有天然的屏障，对生物降解具有一定的抗性［7，8］。采用酶解法降解木质纤维素，首先要采用有效的预处理方法打破纤维素、半纤维素、木质素等高分子间相互交联而形成的天然阻碍，然后应用纤维素酶将预处理产物酶解、糖化，进而发酵得到相应的生
物燃料和生物产品。提高纤维素酶活性和降低纤维素酶生产成本在生物质转化利用中具有重要的价值。
纤维素酶的来源非常广泛，原生动物、微生物（细菌、真菌、放线菌等）都具有合成、分泌纤维素酶的能力，其中通过微生物发酵可实现纤维素酶工业化生产。不同微生物合成的纤维素酶组成上有明显不同，对纤维素的降解能力也存在显著差异。放线菌产纤维素酶的能力较弱，目前研究得较少。细菌和真菌有合成、分泌多种纤维素酶、半纤维素酶的能力，已有众多研究者对其进行广泛而深入的研究，如里氏木霉（Trichoderma reesei）、康氏木霉（Trichoderma koningii）等纤维素等纤维素酶高产菌株已被应用于商业。针对真菌的研究开展的比较早，真菌所产纤维素酶、半纤维素酶多为胞外酶，种类丰富且容易提取、纯化，更方便应用于科学研究或商业化生产。针对细菌的研究正在成为新的热点，原因主要有3点：首先是细菌较真菌生长更为迅速；再者细菌所分泌的酶成分较真菌丰富，更易发挥酶之间的协同效用，对降解纤维素更为有利；细菌对环境的适应力更强，所分泌的酶也更加稳定［9］。本研究试图通过分离和筛选具有较高纤维素酶活性的细菌、并对这些菌的产酶条件进行优化研究，以期发现具有工业化应用前景的纤维素酶生产菌株。
1.1 材料
纳米除臭装置1.1.1 取样 本试验共计选样29个，其中优良菌株来源为：（1）湖北省武汉市狮子山上腐烂的树木、树叶及下方土壤；（2）湖北省武汉市九峰山森林公园腐烂树木、树叶。
1.1.2 培养基 （1）富集培养基R2A（g/L）：酵母粉0.5；蛋白胨-D 0.5、酪蛋白氨基酸0.5、葡萄糖0.5、可溶性淀粉0.5、磷酸氢二钾0.3、硫酸镁0.5、丙酮酸钠0.3、琼脂15.0；（2）纤维素琼脂培养基（g/L）：纤维素粉5.0、硝酸钠1.0、磷酸氢二钾1.0、氯化钾1.0、硫酸镁0.5、酵母粉0.5、琼脂15.0；（3）复筛培养基（g/L）：CMC-Na 10.0、硫酸铵4.0、酸酸氢二钾2.0、硫酸镁0.5、牛肉膏5.0；（4）发酵产酶培养（g/L）：CMC-Na 10.0、牛肉膏3.0、酵母粉0.5、硫酸铵4.0、磷酸氢二钾2.0、无水氯化钙0.3、硫酸镁0.5、吐温-80 2 mL/L。
1.2 方法
1.2.1 菌株分离、纯化 每1.0 g样品用无菌磷酸钾缓冲溶液（PBS）重悬至20 mL，并涡旋高速振荡2 min；将每个样品悬液用无菌PBS以10x梯度稀释；分别取稀释液200 μL涂布至R2A平板上；平板在30℃下培养24 h，根据细菌生长（菌落状态）情况可适当缩短或延长培养时间；根据菌落形态、大小、颜等，挑取单菌落进行纯化，可根据需要进行多次纯
化。
1.2.2 初筛 挑取纯化的菌株单菌落至装有5 mL LB培养基的试管中，进行30℃、180 r/min 过夜培养；各取LB菌液10 μL点到纤维素琼脂培养基中心位置，自然均匀散开，30℃下培养48 h，根据实际情况可适当缩短或延长培养时间；培养完成之后，用碘液（每300 mL ddH2O中含2.0 g KI和1.0 g I2）染［10］；每个平板用滴管滴加约5 mL碘液，静置5 min，有圈出现者可初步定性为具有纤维素酶活性的菌株。
1.2.3 复筛 将初筛所得到纤维素酶产生菌接种到发酵产酶培养基中，恒温30℃、150 r/min振荡转速，培养4 d。取所获得的发酵液，离心转速5 000 r/min、时间10 min，上清液即为粗酶液。以滤纸为底物测定各个菌株的酶活（FPase）。
1.2.4 菌株J1-3-1的16S rRNA序列分析 在菌株J1-3-1划线活化后R2A平板上挑取单菌落，选择细菌通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）、1492R（5'-TACGGCTACCTTGTTACGACTT-3'）进行PCR，由武汉擎科创新生物技术有限公司进行序列测定。将测序结果通过BLAST程序与GenBank中的16S rRNA基因序列进行同源性对比。
1.2.5 发酵产酶条件优化
1.2.5.1 氮源添加量 取100 mL无氮培养基置于250 mL三角瓶中，并分别添加0.0%、0.3%、0.6%、0.9%、1.2%和1.5%牛肉膏。
1.2.5.2 初始pH值 在此前试验的基础上，取100mL培养基置于250 mL三角瓶中，用1 mol/L HCl或1 mol/L NaOH调节培养基的pH值为4.0、4.5、5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0和8.5。
1.2.5.3 吐温-80添加量 在此前试验的基础上，取100 mL培养基置于250 mL三角瓶中，分别添加0.0%、0.2%、0.4%、0.6%、0.8%、1.0%和 1.2%（V/V）Tween-80。
1.2.5.4 接种量 在此前试验的基础上，取适量培养基置于250 mL三角瓶中。然后分别加1%、2%、3%、4%、5%、6%、7%、8%、9%和10%（V/V）菌液（OD600=0.6）。
1.2.5.5 正交试验 对氮源添加量、初始pH、Tween-80添加量、接种量进行4因素3水平正交试验，确定菌株的最佳发酵产酶条件，如表1所示。
1.2.6 酶活性测定方法
1.2.6.1 滤纸酶活（FPase） 取粗酶液1.0 mL于比管中，再放入10 mm×60 mm滤纸条并加入1.0 mL Tris-HCl缓冲液（pH7.0、50 mmol/L），50℃水浴保温，准确计时60 min后取出［11-13］。
1.2.6.2 内切葡聚糖酶（CMCase） 取粗酶液1.0 mL于比管中，再加入1.0 mL 1%的CMC-Na溶液（pH4.8），50℃水浴保温，准确计时60 min后取出，迅速冷却至室温［12，13］。
1.2.6.3 β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase） 取粗酶液1.0 mL于比管中，再加入1.0 mL 0.5%水杨苷溶液（pH4.8），50℃水浴保温，准确计时60 min后取出，迅速冷却至室温［14，15］。sofa燃烧器
酶促反应完成之后，加入2 mL DNS试剂，沸水浴5 min之后取出，迅速冷却至室温。在540 nm波长处测定吸光度OD值，对照葡萄糖标准曲线计算葡萄糖当量。以高温灭活的粗酶液为对照组。酶活性定义：酶促反应每进行1.0 h产生1.0 μmol还原糖所需的酶量定义为1个酶活力单位（U/mL）。
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