(10)申请公布号 CN 101998849 A
狭基线纹香茶菜
(43)申请公布日 2011.03.30C N 101998849 A
*CN101998849A*
(21)申请号 200980112748.8
(22)申请日 2009.04.09
61/044,316 2008.04.11 US
A61K 8/66(2006.01)
A61Q 11/00(2006.01)
A61Q 11/02(2006.01)C12N 9/14(2006.01)C12N 9/24(2006.01)
(71)申请人丹尼斯科美国公司
地址美国加利福尼亚州
(72)发明人S ·金 S ·兰茨 M ·佩普森
(74)专利代理机构北京市中咨律师事务所
11247
代理人黄革生 凌立
(54)发明名称
(57)摘要
本发明描述了来自Hypocea tawa 、里氏木霉
和Trichodermakonilangbra 的分离的α-葡聚糖
酶，以及含有它们的口腔护理组合物。该口腔护
理组合物可用于预防或减少菌斑。(30)优先权数据
(85)PCT申请进入国家阶段日
2010.10.11
(86)PCT申请的申请数据
PCT /US 2009/040013 2009.04.09
汽水热交换器(87)PCT申请的公布数据
WO 2009/126773 EN 2009.10.15(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请
权利要求书 2 页 说明书 23 页 序列表 25 页附图 3 页
1.分离的α-葡聚糖酶，其包含下列氨基酸序列：
(a)与成熟Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性；或者
(b)与成熟Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：3的38-627位氨基酸残基)有至少85％同一性。
2.编码权利要求1的分离的α-葡聚糖酶的分离的多核苷酸。
还原剂加药装置3.包含权利要求2的分离多核苷酸的重组核酸。
4.包含权利要求3的重组核酸的载体。
5.包含权利要求3的重组核酸的宿主细胞。
6.细胞培养物，其包含：
a)生长培养基；和
b)权利要求5的细胞体。
在适于所述分离的α-葡聚糖酶产生的条件下维持权利要求6的细胞培养物。
8.根据权利要求7的方法，其还包括从所述生长培养基中收获所述α-葡聚糖酶。
9.方法，其包括：
接受选自下列的α-葡聚糖酶：
(a)具有与成熟Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；
(b)具有与成熟里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；或者
(c)具有与成熟Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ IDNO：3的38-627位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；以及
将所述分离的α-葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合，以制备口腔护理组合物。
10.根据权利要求9的方法，还包括：
包装所述口腔护理组合物。
11.根据权利要求1的方法，其中α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)。
12.口腔护理组合物，其包含：
a)口腔可接受赋形剂；和
b)权利要求1的分离的α-葡聚糖酶。
13.口腔护理组合物，其包含：
口腔可接受赋形剂；和
选自下列的分离的α-葡聚糖酶：
(a)具有与成熟Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；
(b)具有与成熟里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；或者
(c)具有与成熟Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ IDNO：2的38-627位
氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶。
14.根据权利要求13的组合物，其中α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)。
15.根据权利要求12-14中任一项的口腔护理组合物，其中所述α-葡聚糖酶以所述组合物重量的0.0001％至5％的浓度存在于所述组合物中。
16.根据权利要求12-15中任一项的口腔护理组合物，其还包含第二种酶。
17.根据权利要求16的口腔护理组合物，其中所述第二种酶是脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脲酶或纤维素酶。
18.根据权利要求12-17中任一项的口腔护理组合物，其中所述组合物配制成牙膏。
19.根据权利要求12-18中任一项的口腔护理组合物，其中所述组合物包含增稠剂、表面活性剂、湿润剂和研磨剂中的至少一种。
20.方法，其包括：
在适于所述α-葡聚糖酶活性的条件下将权利要求12-19中任一项的口腔护理组合物与牙齿接触。
21.根据权利要求20的方法，其中所述接触使用牙刷进行。
22.根据权利要求20或21的方法，其中所述方法使得可以预防和/或减少菌斑。
α-葡聚糖酶以及含有其的口腔护理组合物
[0001] 优先权
[0002] 本申请要求2008年4月11日提交的美国临时专利申请序列号No.61/044,316的优先权，其以其整体引入作为参考。
背景技术
[0003] 齿斑的形成导致龋齿、牙龈炎症、牙周病以及最终导致牙齿损失。齿斑是细菌、上皮细胞、白
细胞、巨噬细胞及其他口腔分泌液的混合物。细菌产生高度分枝的多糖(highly branched polysaccharides)，其与来自口腔的微生物一起形成齿斑继续增殖的粘性基质。[0004] 随着齿斑继续积累，出现石头一样硬的白或浅黄沉积物。这些沉积物称为钙斑、牙石或牙垢，其在唾液中由菌斑(plaque)和矿物例如钙形成。
[0005] 对预防和/或减少齿斑以及相关牙齿损坏的新方法有着持续的需要。
发明内容
[0006] 一方面，提供了分离的α-葡聚糖酶，包含下述氨基酸序列，即(a)与天然Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性；或者(b)与Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：3的38-627位氨基酸残基)有至少85％同一性。
[0007] 另一个方面中，提供了编码本发明α-葡聚糖酶的分离多核苷酸以及含有该分离多核苷酸的重组核酸。还提供了含有该重组核酸的载体和宿主细胞。
[0008] 在另一个方面中，提供了细胞培养物。在一些实施方式中，该细胞培养物含有生长培养基和上述宿主细胞的体。细胞培养物可用于提供在适于分离的α-葡聚糖酶产生的条件下维持细胞培养物以产生本发明的α-葡聚糖酶。如果α-葡聚糖酶是分泌的，这可从生长培养基中收获。套筒冠
[0009] 在另一个方面中，提供了产生蛋白质的方法，其包括在适于分离的α-葡聚糖酶产生的条件下维持如上细胞的培养物。在一些实施方式中，该方法还包括从生长培养基中收获α-葡聚糖酶。
[0010] 另一个方面中，提供了方法，其包括接受选自以下的分离的α-葡聚糖酶：(a)具有与成熟Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；(b)具有与成熟里氏木霉(Trichoderma reesei)的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；或者(c)具有与成熟Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：3的38-627位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；以及将该分离的α-葡聚糖酶与口腔可接受的赋形剂混合，以制备口腔护理组合物。在一些实施方式中，α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)。在一些实施方式中，该方法还包括包装该口腔护理组合物。
[0011] 在另一个方面中，提供口腔护理组合物，其包含(a)口腔可接受的赋形剂；和(b)
分离的α-葡聚糖酶。
[0012] 在一个相关方面中，提供了口腔护理组合物，其包含：口腔可接受赋形剂和选自下列的分离的α-葡聚糖酶：(a)具有与成熟Hypocea tawa的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：1的38-635位氨基酸残基)有至少99％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；(b)具有与成熟里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQID NO：2的38-
622位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶；或者(c)具有与成熟Trichoderma konilangbra的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：3的38-627位氨基酸残基)有至少85％同一性的氨基酸序列的α-葡聚糖酶。在一些实施方式中，该α-葡聚糖酶不同于里氏木霉的α-葡聚糖酶(SEQ ID NO：2的38-622位氨基酸残基)。
[0013] 在一些实施方式中，α-葡聚糖酶以组合物重量的0.0001％至5％的浓度存在于该组合物中。
[0014] 在一些实施方式中，该口腔护理组合物还包含第二种酶。在特定实施方案中，该第二种酶是脱氨酶、酯酶、糖苷酶、脂肪酶、氧化酶、过氧化物酶、蛋白酶、脲酶或纤维素酶。[0015] 在一些实施方式中，该组合物配制成牙膏，尽管预见了其他的口腔护理制剂。在一些实施方式中，该组合物例如包含增稠剂、表面活性剂、湿润剂和研磨剂中的至少一种。[0016] 在另一个方面中，提供了方法，其中接受分离的α-葡聚糖酶，然后提供与口腔可接受的赋形剂混合以制备口腔护理组合物。该口腔护理组合物可以包装。
[0017] 在另一个方面中，提供了包括在适于α-葡聚糖酶活性的条件下将本发明口腔护理组合物与牙齿相接触的方法。该接触可以使用例如牙刷进行。在特定情况下，该方法导致对齿斑的预防和/或减少。
附图说明
[0018] 图1显示来自Hypocea tawa(SEQ ID NO：1)、里氏木霉(SEQ IDNO：2)；Trichoderma konilangbra(SEQ ID NO：3)和哈茨木霉(T.harzianum)(SEQ ID NO：4)的α-葡聚糖酶的氨基酸序列比对，以及基于比对的共有序列(SEQ ID NO：5)。显示α-葡聚糖酶的多个特征，例如信号序列、催化结构域、接头结构域以及葡聚糖结合结构域。[0019] 图2汇总与多种无细胞培养溶液过夜孵育后获得的不溶葡聚糖水解物的HPLC分析结果的表格。
[0020] 图3显示在pH4.5和pH6.0的来自表达里氏木霉(T.reesei)、H.tawa和T.konilangbra的推定α-1，3-葡聚糖酶的里氏木霉培养物的上清的活性。天然α-葡聚糖酶在宿主菌株中未检测到。葡聚糖水解反应物根据培养体积而不是蛋白质含量上样。[0021] 定义杨木皮子
[0022] 除非本文中另有说明，否则所有技术和科学术语应为本领域中常规的含义。为清楚起见定义以下术语。其他定义可出现在本说明书的其他地方。
尼龙纤维植绒拭子[0023] 本文所用的术语“α-葡聚糖酶”指水解多糖中1，3-α-D-糖苷键的酶。本文所述的α-葡聚糖酶具有根据IUBMB酶命名法的EC 3.2.1.59的活性，可水解不溶的葡聚糖。α-葡聚糖酶的系统命名为1，3(1，3；1，4)-α-D-葡聚糖3-葡聚糖水解酶。在某些出版物中，此酶可能称为1，3-α-葡聚糖酶。注意，本发明的酶可具有除1，3-α-D-糖苷活性之外的其他活性，包括但不限于1，2-α-D-糖苷活性。
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