新疆农业科学2021,58(2)：197-205
Xinjiang Agricultural Sciences
doi：12.6048/j.inc.1929-4330.2229.02.021
GhCYP85A2-1的克隆与功能分析张翼，邵冬南，薛飞，李虎情，王学峰，李艳军，张新宇，刘峰，孙杰(9河子大学农学=/新疆生产建设兵CDE生态农业G点实验K，新疆9河子832023)
摘要：【目的】开究细胞素P452超家族CYP85A亚家族基因在棉花株高发育中的生物学功能，为陆地棉株高分子育种提供理论依据和基因资源。【方法】J用同源克隆方法，从陆地棉中克隆CYP85A家族基因GhC-YP85A-1，利用烟草脆裂病毒(Tobacco rattle virus,TRV)诱导的基因沉默技术(Virus-inCrceS genn silencing,VIGS)构建GhCYP80A2-1基因沉默载体，利用qRT-PCR技术检测侵染棉花幼苗的基因表达量。【结果】:hCYP80A2-1基因沉默植株的株高显著降低，基因的表达量也显著下降。【结论】；hCYP85A-1基因在棉花株高发育过程中起到重要调控作用。 关键词棉花;CYP05A；株高；病毒诱导的基因沉默
中图分类号:S502文献标识码:A文章编号：1021-4332(2221)22-2197-09
桌卡制作
2引言
【研究意义】作物矮化不仅能提髙抗倒伏能力，也有利于提髙和量和「化作业⑴。陆地棉(Gossypium hirsutum)是锦葵科(Malvvcenn)棉属(GoopUm)双子叶植物，其顶尖生长能力。生要采用人和和施用缩节胺、生长调⑵调控其生长。克隆株髙基因，研究棉花株髙发育分子机制，对培育采收棉花品种重要意义。【前人研究进展】油菜素笛醇(Brassicostn- riids,BRs)髙生理活性的笛体激素，被称为继生长素(Auxin-IAA)、细胞分裂素(Cyts-
kinics,CTK)、赤霉素(Gibaerellics,GA)、脱落酸(AbsUsie Ain,ABA)、乙烯(EtUylenr)ET)之后的
0大激素，主要植物细胞分裂分化⑶、茎的
⑷、根的发育⑸、、：0,7\花粉管延
［5］和种子萌发⑷等生发育过程。素内酯(arassinoVde,BL)作为生物活性最强的一种BRs，在植物生长发育中起着至关重要的作用［7，12,11］o细胞素P452超家族中的CYP50亚家族在BL生物合成起到关键的催化作用。研究发现，番茄CYP85A3、拟南芥CYP55A1能将0-脱氧茶笛酮(0-deoxoCS)氧化为茶笛酮(castaster-one,CS)，拟南芥CYP80A2进一步将CS转化BL，这是植物细胞中BL合成的最步，也键的限速步骤B宀⑷o植物中CYP5AA的突变体大多都表现为植株矮化，如番茄CYP80A2缺陷
突变体因缺乏BL导致植株严重的矮化［77］，豌豆BR 缺失型突变体表现出株高介于野生型和BR突变体之间的表型「⑸，黄瓜CYP85A1基因突变体表现出节间缩短的超紧凑表型U0,17］，竹子CYP85A1基因也被证实促秆及节间伸长的作用血。【本研究切入点】拟南芥CYP50A2介导CS向BL的转化，这是BL生物合成的最后一步，也是重要的限速步骤酗］，但棉花CYP55A基因对棉花株高的影响尚不清楚，研究以拟南芥CYP55A2基因(73G32182.1)的氨基酸序列为查 收稿日期(Receiven)：2222-23-22
基金项目：亘家自然科学基金(31960412)；石河子大学新品种培育专项(YZZX208774)
作者简介：张翼(1994-)女，湖北人，硕士研究生，研究方向为棉花分子育种,(E-mait)703333003@qq
通信作者：小杰(1909-)，男，新疆人，教授，博士，博士生导师，研究方向为棉花遗传育种，(E-mait)sunjie@shzu.edc.
as
19858卷
询序列与陆地棉基因组数据进行比对，获得了该基因在陆地棉的直系同源基因Ghir_ 4076008770，命名为GhCYP8552-1。构建该基因VIGS沉默载体，对棉花幼苗进行侵染，分析其
对棉花株高的影响。【拟解决的关键问题】研究
解析GhCYP8522-1基因在棉花株高发育中的作
用，为棉花矮化分子育种提供参考。
1材料与方法
1.1材料
陆地棉(Gossypium hirsutum L.)品种新陆早
61号由子大学农学院棉花育种课题组提供。新陆早61号棉花种子种植于人养箱
，培养条件设置：温度23七，相对湿度55%，光
周期为14h光照和18h黑暗。待子叶完全平展
(发1d左右)，挑选长势均一的幼苗用
续VIGS侵染实验。病毒诱导基因沉默(VIGS)体
系构建方法中用到的烟草脆裂病毒PTRV1、
pTRV2、pTRV2-GhCHLI重组载体以及根癌农杆菌(Agrobacterium tumefacuns)GV3101均由实验室。
1.2方法
1.2.1陆地棉GhCYP55A2亚家族基因生物信息学
以拟南芥CYP85A2基因(473G38180.1)的氨
基酸序列为查询序列，在陆地棉全基因组数据(ht-tps：///)(Gosspium hirsutum
(AD1)TM-1Genomn HAU v1_a1/v1.1a1.1)中行检索，获得其在陆地棉直系同源基因。用
SMART(/mart,emblheidelberg.de//数据库鉴定该基因结构域。利用ExPASy(
www.^/e/y.pStml/)对该基因的蛋白质残基数(a)、相对分子质量(kD)、理论点
(pl)等基本理和亚细胞行预测分析。利用NCB)Conseaed Domain SearcO(https：//
www.scOi.v/Stacture/cdd//工具对氨基酸序列进行分析。以棉花GhCYP85A2-
1基因(GhU_A7G88778)的氨基酸序列作为查询(Quey)序列，在UniPrvt(https：//wwwi-
Strap=1008)构建基因家族进化树。
1.2.2GhCYP55A2-1基因VIGS载体的构建
取棉花幼嫩叶片，用EASY spin Pice植物
RNA快速提取试剂盒(Aid/))提取棉花叶片总RNA。按照Reverse Transceptaso M-MLV (RNase H-)(TaKaRa)说明书合成cDNA链,-85°C保存备用。
以GhCYP55A2-1基因cDNA为模板，用
PVmer3(plus,com//在线软件设计引物，并在上下物5'端中分入EcoR I
(GAATTC)G Kpn I( GGTACC)酶切位点。以
cDNA为PCR的基因(312bp), PCR反应体系:cDNA模板1.2咽、。x Buff
erg.2pl、dNTPs(2.5mmom/)1.2p!、上、下游引物(1pmol/L)各 1.2pL、Ep-Taq DNA聚合
酶(TaKaRa,5U/pL)8.2pL、ddH20补足至22
pL0反应程序为：94C预变性3min,94C变性38
s,66C退火38s,72C延伸45s,32个循环,72C 延伸1min。目的片段利用琼脂糖胶回收试剂盒
(Tiangea)回收纯化，具体步骤参见说明书。
将回收的PCR产物连接至pGEM-T®Easy 载体(Promega)，转化到大肠杆细胞获得
pGEM-GhCYP5AA2-1，质粒进行酶切验证并送测序(北京华大)o用EcoR)和Kpn)分别对
pTRV2空载体和pGEM-GhCYP55A2-1进行双切，将pTRV2载体进行连接，获得
pTRV2-GhCYP5A2-1重组转到杆细胞。重组行切
司测序，测序结果正确的pTRV2-GhCYP85A2-1重组质粒电击转化到根癌农杆菌GVIH中，挑取单克隆进行PCR验证后-85C用。
1.2.2沉默载体的侵染与转化
新鲜培养的重组载体pTRV2-GhCHLI(体系对照)、pTRV2-GhCYP85A2-1和pTRV2-0。()菌液分别与pTRV1按1：等体积混，离心并收体，以体积的重(1
mmol//MgC/,38mmol/L MES,908mmol/L乙酰丁香酮)调节终浓度(ODg。约8.8)。重悬后的侵
染室3~4h，用将侵染到新陆早61号棉花幼苗子叶,9的
2期张翼等：陆地棉细胞素P45。超家族基因GhCYP85A-1的克隆与功能分析197
植株为野生型对照(WT)，每个处理15株。WT 和接种后植株置于培养箱中,2周后P TRV2-Gh-
CHLI处理组可观察到真叶被漂白;40d后观察并统计pTRV2-GhCYP50A2-1、pTRV2-22(空白
)和WT表型，分别采集其幼嫩叶片储-
80°C备用，重复3次。采用SPSS10.e软件进行差异显著性分析，应用最小显著性差数法(LSD)进
行单因素方差分析;Duncan多重比对分析，显著卷圆机
性水平为P<2.25°
1.1.1GhCYP50A2-1基因沉默效率检测
分别提取侵染44d后的pTRV2-GhC-
表1YP50A2-1、pTRV2-02(空白对照)和WT幼嫩叶的总RNA，反转录合成cDNAo以UBQ7作为
内参基因，Primer 3.2在线软件设计qRT-PCR
特异物,qRT_PCR分析基因的相对表
达量。qRT-PCR反应体系(共19r L)：c DNA模1pLSYBRGreen I染料(Roche)5r L、上下游引物(19pnol/L)各2.25RL,ddH2O 3.1r L°qRT -PCR反应程序为：C4O C预变性11^,94*变性15s,60C退火22s,72C延伸30s,42个循环，72C1min，每个实验样3次重复，使用2f法计算基因的相对表达量。表1
Table1PrimeFS used in the experiment
物名物下游引物目的Prirner name Foiward primer sequence(5，-3，)Reverse prirner sequence(5'-3')Purpose
VGhCYP85A5-1GAATTCGGTGATTTTTGGGGTGTTTG GGTACCTCAAGCATGGACTGTGGGTA克隆基因目的片段UBQ7GAAGACCTACACCAAGCCCAAG CGGACTCTACTCAATCCCCACC qRT-PCR内参QGhCYP85A5-1GGGCAGATGAACCAATTGAATGGA CCAGCCTTTAGGAATCACATACCCA qRT-PCR表达检测
2结果与分析
2.1陆地棉CYP85A2亚家族基因生物信息学
研究表明，以拟南芥CYP50A2基因
(73G32182.1)蛋白序列为查询序列在棉花全基因组数据库(https：///j中进行
Blasts比对，共得到6个陆地棉GhCYP50A2基因。棉花CYP50A2亚家族基因全长在1728~2445
bp，编码序列(coding sequence,CDS)长1116~1
441bp，编码371~466个氨基酸，家族成员蛋白质分子量在42.743~53.645kD，理论等电点
(pI)介于&95~9.31。GhCYP50A2亚家族成员亚细胞定位在内质网(Endon/smic reticulum)和
质膜(P/sma membrane)卜。
6个陆地棉基因与拟南芥CYP50A2氨基酸序列相似性在07.57%~54.89%，按相似性高低分
别命名为GhCYP50A2-1至GhCYP50A2-6。利用NCBI Conserved Domain Senrch对陆地棉GhC-
YP50A2氨基酸序列进行保守域分析,6个基因均属于细胞素P450超级家族成员，其中GhC-
YP80A2-1具有典型的素笛体6-氧保守结构域PLN22774，该基因素合成相
关。表2
表2陆地棉CYP55A亚家族成员序列
Table2Sequence analysis of CYP854subfamily members in Gossypium hirsutum L.
基因名Gene name
序列号
Sequence number
编码序列
CDS
氨基酸
序列长度
Amino acin
length(aa)
亚细胞测
SuCcellular location
preniction
匹配类型
Hit type
保守结构域
Short name
GhCYP55AA-1Ghr_A27G0087771428400Engoplasmic reticelum specific PLN22777 GhCYP55AA-5
GhU_A7G2192221322433Engoplasmic reticulum superfamily p52superfamily GhCYP55AA-3Ghr_D15G0087721428400Plasma membrane superfamily pP52superfamily GhCYP55AA-4Ghr_A15G0277941421400Plasma membrane superfamily pP52superfamily GhCYP55A5-5Ghr_D27G008815272427Engoplasmic reticelum superfamily pP52superfamily GhCYP55AA-0GhU_D27G2195971119371Plasma membrane superfamily pP52superfamily
20058
卷
2. 2
陆地棉与其他物种CYP85A 氨基酸序列比 对及进化树
研究表明，利用DNAMAN 软件对拟南芥
CYP5552
( A73G30185. 1 )、菜豆 CYP55A (069F95)、番茄 CYP8548 (043147)、野生大豆
CYP55A
(0A0B2P9&)、烟草 CYP8548 (45A6P9)
和6个陆地棉CYP55A2家族基因氨基酸序列进
行多重序列比对，发现厮CYP5A -6氧分子结
合区不完整,GhCCP85A2 - 3 和 GhCYP55A2 - 6 血
红素结合区缺失，其余基因氨基酸序列均含
整的CYP85A 基因家族高 的结构域:C -螺
旋、脯氨酸富集区、K -螺旋、Glu - X- X- Arg 结
构域、氧分子结合区和血红素结合区[14]0图8
AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GhCYP85A2-6GIMMMILG. LLVIIVCLCll
AILGV.LVLLLCFCS IFLSS.FFGLCI^ei]AFLMAIVVVGVVLVLCFCsl AFILVFLAF . FFGLCIFSIl GVLMVIVG . VFVMVLCMlG
GVLMVIFG .VFVMVLCMC
AVLWVIV . AVLVWIV .
C-helix
GVKYNQ . EVRXRK . QVKXNK .
HLGCPT nLGCPT yLGCPT nLGCPT HLGCPT nLGCPT
J lgcft S lgcft J lgcpt J lgcpt R lgcft
7878787978787978787978
AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GhCYP85A2-6
CILG CILC EILG CILG EILG EILG EILG EILG EILG EILC I eilg
TF KC KC KC KC KC KF K? KC KC
Proline Rich 158158158159158158159158158159158AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
汽车膨胀水箱
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GhCYP85A2-6238237237238237237238237237238237
AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GhCYP85A2-6
挂裤架KESGETFI KASQDVHV RASKEIQH RASHETYr
氧S keiqe
自锁角度R 斑EESH8 RGCQESHB RA5SIAYE
RGNQESHK RESEESHK
!R M EEMNPHF
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V I V I I I I I I I L L L L Q C ~c ~r x c ~Q
I M I M I I I I I I
M M M H M M M H M M M
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Y
Y Y
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KYLHDHl KXLHEHI KYLHEHl KYLHEH1 KXLHEH1 KYLHEH1KYLHCH1 KYLHDHl KYLHEH! KYLHEHl KYLHEHl
:F2:EE
317316316317316317318316316318317AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GHCYP85A2-6
EELTLE DPIECN DFIEYN EFLECN EEIEYN EFIEWN DPIEWN EAVHWE EAVHWE DPIEWN EFIEWN
S ftravi 5FTRAV] 5FTRAV] SFTRAV3 gFTRAV]SFTRAVJ 5FTRAV]SFIRAV16FTRAVI 3FTRAV] 5FTRAVI ETSRLA
ETSRLfl ETSRLfl ETSRLA ETSRLA ETSRLA ETSRLA ETSRLA ETSRLA ETSRLA ETSRLA
JGWRIYVYTRETNYETSLTfErPMTFNPWRWMEK 5GWRIYVYTREINYEPFLIHEPLTFNPWRWLGN jGWRIYVYTRELNYCERLTiPEPYoFNPWRWMEK
J gwriyvytreinycpflypcpltfnpwrwi -iek J g WRIYVXTRELNYCPRL'XPEPYAFNEWRWLEK
iGWRIYVYTREINYCPFLTePCPLAFNPWRWMEK jGWRIYVYTREINYEPFrXPCPLAFNPWRWMEK SGWKIYVYTREINYEPFLyPEFLTFNEWRWLCK
J gwkiyvytreinxcpflypefltfnpwrwlgk
5GWRIYVYTREINYEPFIYPEPLAFNPWRWMV5
397396396397396397398396396398371：三
L
AT3G30180.1Q69F95Q43147A00B2P9K9A5X6P9
GhCYP85A2-l GhCYP85A2-2GhCYP85A2-3GhCYP85A2-4GhCYP85A2-5GhCYP85A2-6
Glu-X-X-Arg Dioxygen-binding domain
SLESKSYFLLEGGGVR 匚CPGKELGHSEVSSFLHYFyTKYRWEENGECKLHVFPRVSAEKGYELRCSPY SLESQSHFLIFGGGTRQCPGKELGIAEISTFLHYEVTRYRWEEVGGEKLMKFPRVVAPNGLBIRVSSFS SUEHQNSFLVFGGGTRQCPGKELGVAEISTFLHYEVTKYRWEEIGGCKLMKFPRVEAPNGLRIRVSAH SLESKNYFFIFGGGTBQCPGKELGZTEISTFLHYFVTRYRWEEVGGEKVHKFPRVEAPNGLHIRVTSY S1ENQNSFLVFGGGTRQCPGKELG T .«EISTFLHYFVTKYKWEEVGGCKLMKFPRVEAPNGLRIRVSTY
glesgnyflifgggtrqcpgkelgiaeistf £ticn
SLESQSNFLIFGGGTBQCPGKELGIAEISTFLHYEITRYRWEEIGGEKLMKFPRVEAPNGLHIRVSSY NLESHNYCFIFGGGSBLCPGKELGLLQVSIFLHYEVTSYRWEEVGRNEIHQFPRVEAPKGLHIRISNYH
MLESHNYCFIFGGG^lXPGKEEeLLQVSIFLHYFVTSYRWEEVGRNEIHQFPRVEAPKGLBIRILNYH ...NCHIFLIB ..........................................LFNFIINEMKVLMNVGCKLGISK
465465464465464433466465465429
Heme binding
图1陆地棉与其他物种CYP85A 蛋白多重序列比对
Fig.
1 Multiple sequences alignment of upland cotton CYP85A and closely
related proteips in otOer
species
2期张翼等：陆地棉细胞素P450超家族基因GhCYP55A2-1的克隆与功能分析281
研究表明,GhCYP55A2-1、GhCYP52-2、
GhCYP85A2-5和GhCYP55A2-6基因聚集在一个分支，与核桃和豆科植物亲缘关系较近；GhC-
YP552-3和GhCYP55A2-4基因聚集在另一个分支，与向日菊科植物亲缘关系较近。6个陆地棉CYP55A蛋白序列中，GhCYP55A2-1与拟南芥CYP55A2（2TG3818.1）相似性最髙，达到69.52%,GhCYP55A2-1基因是CYP5A亚家族成员，GhCYP55A2-1可能具有CYP55A家族成员相似的生物功能，参与陆地棉BL的合成。图2
32
36
22
21
39
100
99
99
-
---------Q69F95(菜豆CYP85A)
------------------A0A072TX43廣藜苜蓿CYP85A)
—A0A0B2P9K9(W生大豆CYP85A)
A0A1S3VWW6(绿豆CYP85A1)
99
A0A2I4EH00(核桃CYP85A)
GhirA07G008770.1(GhCYP85A2-l)
------------GhirD07G008810.1(GhCYP85A2-5)
I----------■Ghir A07G019260.1(GhCYP85A2-2)
wol—GhirD07G019590.1(GhCYP85A2-6)
----------A5X6P9草CYP85A1)
100
J—A0A2G2XHP2&椒CYP85A1)
J I——Q43147(番茄CYP85A1)
96>—M0ZLR7(±豆CYP85A1)
------------------------------------AT3G30180.1(拟南芥CYP85A2)
AT5G38970.1南芥CYP85A1)
—A0A1S3CA65制瓜CYP85A)
1001—GhirA13G007990.1(GhCYP85A2-4)
L GhirD13G008760.1(GhCYP85A2-3) A0A251RP39(向日葵CYP85A1)
寿盒一A0A2U1NBQ2淸蒿CYP85A1)
100
75
96
100
0.05
图2不同物种CYP55A蛋白系统进化树
Fig.2Phylogenetic tree analysis of CYP55A protein among different species
2.3GhCYP85A2-1基因VIGS载体的构建
研究表明，以陆地棉品种新陆早61号GhC-
YP55A2-1基因CDS序列为模板，设计VIGS沉默片段引物进行PCR（图3A），将回收的
PCR扩增产物（312bp）连接到pGEM-TEasy载体。用EcoR）和Kpn）将目的片段进行双酶切验
证，观察到与目的条带相同大小片段（图3B）。将酶切所得目的收到pTRV2载体9
pTRV2-GhCYP55A2-1质粒进行双酶切验证，可观察到目的条带及载体条带（图3C）o将测序验
证正确的pTRV2-GhCYP55A2-1质粒转化农杆菌GV3121，并进行菌液PCR验证，获得阳克隆（图3D）。图3
2.4沉默载体的侵染与转化
研究表明，pTRV2-GhCHL（pTRV2-GhC-YP55A2-1和pTRV2-08分别与pTRV1菌液等量混合，离心收集菌体，悬浮后侵染新陆早61号棉花幼苗子叶。侵染2周后可观察到pTRV2-
GhCHLI菌液处理的棉花漂白，试验材料种植环境适宜，且该VIGS体系适用验中棉花
基因功能研究。侵染44d后分别统计pTRV2-GhCYP55A2-1、pTRV2-08和WT处理组棉花株高。pTRV2-08和WT处理组棉花株高无显著性差异，而pTRV2-GhCYP55A2-1处理组的棉花株高比pTRV2-08和WT显著（P<8.25）降低。棉花GhCYP55A2-1基因沉默组与pTRV2-00和WT组相比，平均株高分别降低5.3、5.6cm。图4
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