陈亚东;薛金嫚;徐婷;刘华;雷洁;甘毅
【摘 要】甘油酯是植物体内重要的初生代谢产物,参与到细胞膜脂的形成,薄层层析谱法是研究植物脂类代谢中分离甘油酯的常见方法.为了获得良好的脂类成分分离效果,相关文献多采用:甲醇:水(65:25:4)的溶剂配比来作为双向TLC第一向的展开相.但在一些甘油酯含量较少的样本中,上述溶剂相无法获得良好的分离效果.本研究对上述溶剂系统进行优化,分别采用:甲醇:氨水(65:35:5)和:丙酮:甲醇:乙酸:水(50:20:10:10:5)作为展开相.结果表明,改进后的溶剂系统能够高效地分离植物组织样本中的糖脂和磷脂,在硅胶板上形成清晰的、不连续的脂类斑块.上述方法对有效分离植物样本中的脂类组分具有一定的实用价值. 【期刊名称】《江苏农业科学》
【年(卷),期】2018(046)024
【总页数】4页(P235-238)
【关键词】薄层谱分析;甘油酯;糖脂;磷脂;分离
【作 者】陈亚东;薛金嫚;徐婷;刘华;雷洁;甘毅
【作者单位】浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安311300;浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安311300;浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安311300;浙江农林大学林业与生物技术学院,浙江临安311300;南京农业大学农学院,江苏南京210095;浙江农林大学农业与食品科学学院,浙江临安311300
【正文语种】中 文
【中图分类】O657.7+1;O658.1
脂类(lipids)是生物细胞膜的主要组成成分，在植物光合作用、细胞信号传导、逆境胁迫等生命活动中扮演着极其重要的角[1-5]。从极性上分，脂类可分为极性脂和中性脂，前者包括单半乳糖二酰甘油(mono galactosyl diacyl glycerol，简称MGDG)、双半乳糖二酰甘油(di galactosyl diacyl glycerol，简称DGDG)、硫脂-硫代异鼠李糖二酰甘油(sulfo quinovosyl diacyl glycerol，简称SQDG)、磷脂酰甘油(phosphatidyl glycerol，简称PG)、磷脂酰胆碱(dcdc电路
phosphatidyl choline，简称PC)、磷脂酰乙醇胺(phosphatidyl ethanolamine，简称PE)、磷脂酰肌醇(phosphatidy linositol，简称PI)、磷脂酸(phosphatidic acid，简称PA)等，后者包括三酰基甘油(triacyl glycerol，简称TAG)、二酰基甘油(diacylglycerol，简称DAG)等。
长期以来，将各种甘油酯进行有效分离，是深入进行植物脂类代谢研究的前提条件。到目前为止，分离植物甘油酯的方法主要有薄层层析谱分析(TLC)、柱层析谱法、高效液相谱(HPLC)等。TLC是一种快速、准确分离脂质的重要方法，它通过不同极性的脂类在固定相和展开相中的相对移动速率差异将脂质进行分离并显，从而进行脂质含量和组分的测定。由于TLC方法具有快速、直观、操作简便和廉价的优点，所以在脂类代谢领域应用最为广泛，并且该种方法也广泛应用于检测酶的活性[6-8]。但是，TLC分离脂质的效果易受到外界环境条件的影响，如气温、湿度等。目前，常见的TLC分离分为单向和双向2类。单向分离溶剂系统常采用正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(体积比70 ∶30 ∶1)作为展开相，用于分离植物三酰基甘油(TAG)和极性脂[9]。也有一些研究采用丙酮 ∶甲苯 ∶水(体积比91 ∶30 ∶8)作为展开相，分离植物样本中的糖脂和磷脂[10]。由于单向TLC不能很好地分离出PC、PE、PI、PS等磷脂组分，所以双向TLC应运而生。双向TLC是将点样后的硅胶板先进行一个方向的层析展开，然后将层析板顺时针旋转90°，进行第2个方向的层析。结束后
显刮板，刮取不同的脂质组分斑块，进行后续的分析。在相关文献中，双向TLC常采取 ∶甲醇 ∶水(体积比65 ∶25 ∶4)进行第一相展开，然后再使用 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(体积比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)进行第二相分离展开[11]。上述溶剂系统在脂类研究中非常常见，适用于大多数植物种子样本的脂质分离。但是，笔者在使用上述溶剂系统分离拟南芥幼苗、烟草叶片等甘油酯含量很低的样本时却发现，该方法在单向和双向TLC试验中，均无法得到良好的脂类分离效果，各种脂质斑块聚集在一起，不能很好进行区分。为了解决上述问题，笔者尝试用新的溶剂系统来优化双向TLC，开发了以 ∶甲醇 ∶氨水(体积比 65 ∶35 ∶5)和 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(体积比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)作为第一和第二展开相的双向TLC分离方法。该方法可以有效地分离油脂含量较低的植物样本中的糖脂和磷脂，为研究植物膜脂代谢提供了一种简便有效的工具。
1 材料与方法
1.1 仪器与试剂
口香糖电池Agilent 7080B型气相谱仪，美国，配置FID检测器；DB-23谱柱，TLC Silica G 60型硅胶板，1.05721.0001，默克集团，德国；37种脂肪酸甲酯标准品，FAMQ005，AccuSta
电玉粉地面数字电视接收机>电极糊ndard，美国；磷脂酰甘油(PG)标准品，841188P，Avanti，美国；磷脂酰乙醇胺(PE)标准品，P8193，Sigma，美国；磷脂酰胆碱(PC)标准品，P7443，Sigma，美国；磷脂酰丝氨酸(PS)标准品，P0474，Sigma，美国；磷脂酸(PA)标准品，830856p，Avanti，美国；磷脂酰肌醇(PI)标准品，P0639，Sigma，美国；心磷脂(cardiolipin，CL)，C0563，Sigma，美国；振荡仪(VORTEX-GENIE 2)；大型低温离心机，eppendorf 5810R；冰箱，三洋化学试剂有限公司；氮吹仪，米欧仪器；数显恒温金属浴，米欧仪器；正己烷，百灵威；甲醇，百灵威；，西陇科学；丙酮，高晶化工；甲酸，生工生物工程(上海)股份有限公司；28%氨水，国药集团；浓硫酸，西陇化工股份有限公司；冰乙酸，上海凌峰化学试剂有限公司；2，6-二叔丁基-4-甲基苯酚，BHT。
1.2 样本总脂的提取
2017年5月，在浙江农林大学平山温室，以播种后15 d的拟南芥植株(哥伦比亚生态型)幼苗和完全成熟的烟草(K326品系)叶片为材料，称取0.5 g样品鲜质量，在液氮中磨成粉末，加入6 mL提取液( ∶甲醇 ∶甲酸，体积比10 ∶10 ∶1)，振荡混匀，置于-20 ℃过夜。以3000 g转速离心10 min，吸取上清液，转移到12 mL玻璃管中。在沉淀中，加入三
氯甲烷 ∶甲醇 ∶水(体积比5 ∶5 ∶1)，振荡混匀，3 000 g 离心10 min，吸取上清，合并到第1步的上清中。在合并的上清中，加入3 mL H3PO4(0.2 mol/L)和KCl(1 mol/L)混合液，振荡混匀，3 000 g离心10 min，吸取下层相，氮吹浓缩至500 mL体积。将转移到2mL安捷伦进样瓶中，-20 ℃保存备用，此样本为总脂提取物，可以用于分离中性脂和极性脂。
1.3 单向薄层层析分析
1.3.1 中性脂的分离 配制溶剂相正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(体积比70 ∶30 ∶1)，置于层析缸中，使缸中蒸气压达到充分饱和。在120 ℃烘烤处理2 h的层析硅胶板上，用铅笔在距离底边2 cm处轻划横线，每2 cm做1个标记，用于点样。然后，待硅胶板降至室温，用毛细玻璃管吸取50 mg样品进行点样，同时加入4 μg的橄榄油作为参照，进行层析展开。当展开相液面距离玻璃板上沿1 cm时，结束层析，采用碘蒸汽或者樱草黄对硅胶板上的脂类斑块进行染。
1.3.2 分离糖脂和磷脂 用0.15 mol/L硫酸铵浸泡硅胶板30 s，在空气中放置2 d之后，120 ℃活化2 h。配制展开相溶剂系统(丙酮 ∶甲苯 ∶水，体积比91 ∶30 ∶8)，在层析缸中充分
饱和1 h。在硫酸铵处理的硅胶板上，距离底边2 cm处，分别添加150、125、100、75、50、25 mg的样品，各样品间距2 cm，在另一块相同的硅胶板上分别加入10 μg的各种磷脂标准品。将加样后的硅胶板轻轻放置到层析缸中，盖紧上盖，进行层析，待溶剂线到达距离硅胶板顶端1 cm处，取出硅胶板，在通风橱中自然风干，均匀喷施0.5 mg/mL樱草黄溶液，在紫外灯下观察各个脂类成分形成的斑块。
1.4 双向薄层层析分析
在经过活化的硅胶板上，用铅笔标记点样位置，在距离底边和左侧边2 cm处，用玻璃毛细管分别吸取75 mg样品，均匀轻柔地点在3块相同处理的硅胶板上，进行双向TLC分离。首先将硅胶板垂直插入第一向层析缸中，展开溶剂为 ∶甲醇 ∶氨水(体积比65 ∶35 ∶5)或者 ∶甲醇 ∶水(体积比65 ∶25 ∶4)，当溶剂线到达顶部，取出硅胶板，在通风橱中，将残留的溶剂充分挥发。然后将硅胶板顺时针旋转90°，迅速插入第二向层析缸中，第二向溶剂系统为 ∶丙酮 ∶甲醇 ∶乙酸 ∶水(体积比50 ∶20 ∶10 ∶10 ∶5)。当溶剂线到达顶部时，取出硅胶板，在通风橱中，将残留的溶剂充分挥发。最后，在晾干的硅胶板上喷施樱草黄溶液，在紫外灯下进行观察、拍照。光纤调整架
1.5 脂类的甲酯化和气相谱分析
在硅胶板上，用铅笔标记分离后的各个脂质组分，用刀片刮下，倒入12 mL玻璃瓶中。加入2 mL甲醇(含有1%硫酸和0.01% BHT)和7.5μg C17：0 TAG内标，80 ℃加热反应2 h，在冰上冷却1 min，加入2 mL的0.9%NaCl溶液和2 mL正己烷，振荡萃取，3 000 g离心10 min，吸取上层正己烷上清液，转移到玻璃管中(注意不要吸入下层水相)。将正己烷浓缩至20 μL，置于安捷伦2 mL进样瓶中，在7890B型气相谱(DB23谱柱、FID检测器)上进行GC分析，具体分析参数设置如下：载气为氦气，进样口温度260 ℃，分流比为20 ∶1，柱温箱起始温度为160 ℃，以20 ℃/min的速度升温至 240 ℃，保持5 min，FID检测器的氢空比设置为1 ∶10。
2 结果与分析
2.1 经典溶剂系统对低油组织样本中的极性脂分离效果
以往的脂类研究常以正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(体积比 70 ∶30 ∶1，溶剂系统A)作为单向TLC的展开相，此溶剂系统具有稳定、重复性好等优点，不仅广泛应用于动物以及微生物，而
且也应用于植物样本的中性脂和极性脂分离。本研究使用了该溶剂系统对烟草叶片等油脂含量极低的营养组织样本进行了层析分离。从图1可以看出，通过碘蒸汽染或喷施樱草黄，紫外线照射成像，使用正己烷 ∶乙醚 ∶乙酸(体积比70 ∶30 ∶1)作为展开相，很好地分离开了样本中的中性脂和极性脂，从硅胶板上沿到点样原点，依次为固醇脂(sterol ester)、三酰基甘油(TAG)、二酰基甘油(DAG)等中性脂，而极性脂(MGDG、DGDG、PC、PG、PE、PI、PA、PS等)则聚集在点样原点周围，此外，一些含量相对较少的物质，如游离脂肪酸等，也被分离出来。由于烟草叶片中的中性脂(主要是TAG)含量极低，样本叶龄对分离效果影响很大，生长后期，衰老的叶片样本(如4～6周龄的成年拟南芥)脂质组分可以被上述方法分开，而幼嫩叶片中中性脂含量极低，上述系统不能很好区分。
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