(10)申请公布号
(43)申请公布日 (21)申请号 201510053386.7
(22)申请日 2015.02.02
A01D 91/00(2006.01)
地址250100 山东省济南市历城区工业北路
202号
(72)发明人罗振 董合忠 孔祥强 代建龙
李维江 唐薇 张冬梅 辛承松
(74)专利代理机构济南诚智商标专利事务所有
限公司 37105
代理人
韩百翠
(54)发明名称
(57)摘要
本发明公开了一种微损伤韧皮部收集棉花伤纱窗角码
流液的方法。它采用主茎基部直径不小于0.5cm
的棉株，先用支撑物固定拟定的切口处，刮除1/4
周长的表皮、皮层、韧皮部和形成层，切除木质部
和髓，清洗干净切口后用脱脂棉吸收伤流液，用去
离子水洗脱后浓缩洗脱液备用。本发明的伤流液
收集方法，通过保留大部分韧皮部，维持了地上部
对根系的联络，收集到的伤流液更能真实地反映
植物生长发育和代谢情况，具有重要应用价值，可
用于棉花等双子叶作物开展地上部和根系互作关
系的研究，如干旱胁迫、盐胁迫下地上部和根系互
作关系的研究。(51)Int.Cl.
(19)中华人民共和国国家知识产权局(12)发明专利申请权利要求书1页 说明书4页 附图1页
(10)申请公布号CN 104718900 A (43)申请公布日2015.06.24
C N 104718900
A
1.一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，采用茎基部直径不小于0.5cm的棉株，先用支撑物固定拟定的切口处；然后破坏棉株1/4周长的表皮、皮层、韧皮部和形成层，切除内部木质部和髓，清洗干净切口后，将脱脂棉放入切口中，收集伤流液。
2.一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，
绑扎带
(1)棉株主茎的切割
选取7-8片以上真叶，主茎基部直径不小于0.5cm的棉株；在主茎基部一侧与茎平行绑上一根支撑杆；在主茎基部另一侧，用锋利刀片切除1/4周长、高度为0.3cm的表皮、皮层、韧皮部和形成层，露出木质部；在露出木质部的两端将全部木质部和髓切断，取出切断的木质部和髓；
(2)伤流液的收集
先用去离子水冲洗切口内部3-5次，洗净后脱脂棉吸干切口内部和表面水分；然后新取脱脂棉放入切口，然后用封口膜将脱脂棉和棉株包扎好；到收集时间后，切开封口膜，揭开，取出脱脂棉，称重，计算出所收集伤流液的重量，用去离子水洗脱，然后用真空浓缩仪将洗脱液浓缩备用。筋膜放进B里面
3.如权利要求1或2所述的一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，所述步骤(2)使用的脱脂棉先后用0.1mol/L的稀盐酸、蒸馏水、去离子水清洗，烘干，装入洁净的Eppendorf管中待用。
4.如权利要求1或2所述的一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，所述伤流液收集时间为2～12小时。
5.如权利要求1或2所述的一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，所述支撑杆长3cm、直径为0.3cm。
拼图板一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种收集棉花伤流液的方法，具体为通过小部分破坏表皮、皮层、韧皮部和形成层并取出一小段茎秆木质部和髓，微损伤收集棉花伤流液的具体方法。
背景技术
[0002] 棉花主茎由外向内主要由表皮、皮层、韧皮部、形成层、木质部和髓组成(见附图1)。表皮和皮层起保护作用，韧皮部的主要作用是由上而下运输有机物，木质部主要是负责将根吸收的水分及溶解于水里面的离子向上运输，以供其他器官组织利用。近年来研究发现，韧皮部和木质部还有运输信号物质的作用，担负着地上部枝叶和地下部根系间的信息交流。
[0003] 伤流液是植物伤口的输导组织(木质部)的汁液，受根压作用使其在导管中向地上部分移动而流出；同时，不可避免的还有植物的细胞液和组织等流出。植物根系伤流量是根系生理活性强弱的重要指标，能够较好地反映处植物吸收水分、养分状况，以及根系活力及根系物质代谢情况。同时，近年来的研究还证明伤流液中含有植物激素(细胞分裂素，脱落酸等)，作为“根–冠”互作信号分子，在生长发育以及多种胁迫应答中起着重要作用。因此，植物根系伤流的收集和研究十分重要。
[0004] 收集植物伤流液的方法很多并在不断完善，但迄今采用的都是直接切断植物主茎基部进行收集。这种方法对于植物伤害大，而且切断主茎后，使地上部和根系失去了联系，也切断了地上部分对根系的养分运输和调节作用，不能完全反映植物在生长发育或逆境胁迫下的真实情况，根据伤流液开展研究的准确性就要大打折扣。因此，建立一种既能收集伤流液，又能维持地上部对根系养分运输和调节作用的伤流液收集方法十分必要。
发明内容夜光路面
[0005] 本发明的目的是要解决传统收集伤流液方法的不足，提供一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法。该方法采用茎基部直径不小于0.5cm的棉株，破坏其1/4周长的表皮、皮层、韧皮部和形成层，切除内部木质部和髓，在保留大部分韧皮部以维持地上部对根系联系的基础上，收集木质部伤流液。
[0006] 本发明所采用的技术方案是：一种微损伤韧皮部收集棉花伤流液的方法，其特征是，采用茎基
部直径不小于0.5cm的棉株，先用支撑物固定拟定的切口处；然后破坏棉株1/4周长的表皮、皮层、韧皮部和形成层，切除内部木质部和髓，清洗干净切口后，将脱脂棉放入切口中，收集伤流液。
[0007] 具体包括以下步骤：
[0008] (1)棉株主茎的切割
[0009] 选取7-8片以上真叶，主茎基部直径不小于0.5cm的棉株；在主茎基部(子叶节下2cm处)一侧与茎平行绑上一根支撑杆(钢条、铁丝等)，以支撑棉株防止切割后折断；在主茎基部另一侧，用锋利刀片切除1/4周长、高度为0.3cm的表皮、皮层、韧皮部和形成层，露
出木质部；在露出木质部的两端用刀片将木质部切断和髓，用解剖针和刀片小心取出切断的木质部和髓，注意勿伤及剩余的韧皮部等组织，保持下切面平整(见附图2)；
吊耳[0010] (2)伤流液的收集
[0011] 脱脂棉用稀盐酸(0.1mol/L)、蒸馏水、去离子水清洗，烘干，装入洁净的Eppendorf管中待用；
[0012] 先用去离子水冲洗切口内部3-5次，以除去破损细胞的溢出物，洗净后用上述处理好的脱脂棉吸干切口内部和表面水分；然后新取脱脂棉0.1g放入切口，然后用封口膜将脱脂棉球和植株包扎好；到
收集时间后，用刀片小心切开封口膜，揭开，用镊子取出脱脂棉，称重，计算出所收集伤流液的重量，用2-3ml去离子水洗脱，然后用真空浓缩仪将洗脱液浓缩到0.5-1ml备用。
[0013] 上述伤流液收集时间可根据实验要求予以调整，一般收集2～12小时。[0014] 上述支撑杆一般长3cm、直径为0.3cm。
[0015] 本发明的伤流液收集方法和传统方法相比，具有以下优点：该方法提高了结果的准确性。保留了大部分韧皮部，收集的伤流液能够更准确地棉花的生长状况，特别是适合研究地上部信号对根系的影响，尤其是对根系影响较大的胁迫处理，如干旱、盐分胁迫等，根系伤流较弱，伤流液收集相对困难，并且长时间收集伤流液根系失去养分和信号物质输入后变化较大，不能准确地模拟棉花的生理状况。本方法保留了大部分韧皮部，有利于维持根系养分供给和信号物质的调控，更准确地模拟棉花的真实状况；本发明不仅适用于棉花，也适用于其他大部分双子叶植物。
附图说明
[0016] 附图1为棉花主茎的截面示意图；
[0017] 附图2是微损伤韧皮部收集棉花伤流液方法的示意图；其中左图为对棉株主茎进行切割的示意图；右图为切口处的截面示意图；从左图可以看出：在主茎一侧与茎平行绑上一根支撑杆；在主茎基
部另一侧进行1/4周长的切割；从右图可以看出：本发明的方法切除了切口处全部的木质部和髓，切除了1/4的表皮、皮层、韧皮部和形成层；
[0018] 图中，1、表皮；2、皮层；3、韧皮部；4、形成层；5、木质部；6、髓。
具体实施方式
[0019] 实施例1：
[0020] 取温室内基质培养8片真叶棉花6株，茎基部直径为0.6cm的棉株。用50mmol/L 氯化钠溶液处理1周，然后在叶片喷施1％的尿素，每株10ml，每天早晚各喷一次。处理3天后，其中3株用常规方法取出伤流液，在子叶节处切断茎杆，去掉头部，用去离子水冲洗切口3次，洗净后用准备好的脱脂棉(稀盐酸、蒸馏水、去离子水清洗，烘干，装入洁净的50ml Eppendorf管中待用)吸干切口内部和表面水分，取上述脱脂棉0.1g放在切口上，最后用5cm×5cm取样塑料袋套好，使脱脂棉与切口充分接触但不要太紧，用皮筋或线绳将塑料袋绑在下部棉秆上。其余3株棉花用微损伤韧皮部的方法收集棉花伤流液，具体操作如下：在茎基部一侧与茎平行用封口膜绑上一个长3cm，直径0.3cm的铁丝，固定点选择在铁丝的两端，以固定棉株防止切割后折断。在茎基部另一侧1cm处，用锋利刀片切除1/4周长，高度
0.3cm的表皮、皮层、韧皮部和形成层，露出木质部。在露出木质部的两端用刀片将木质部和髓切断，切口不能过深，以免破坏保留的韧皮部，用解剖针和刀片小心取出切断的木质部和髓，进一步破坏剩余的木质部并取出，注意保持下切面平整。先用去离子水冲洗切口内部3次，以除去破损细胞的溢出物，洗净后用准备好的脱脂棉吸干切口内部和表面水分，取上述脱脂棉0.1g放入切口，最后用封口膜将脱脂棉球和植株包扎好，不要包扎太紧，以便于棉球吸收伤流液。12小时后收集伤流液，用刀片小心切开封口膜，揭开，用镊子取出脱脂棉，称重，计算出所收集伤流液的重量，用3ml去离子水洗脱，定容到25ml。常规方法取出的伤流液同样定容到25ml，用原子吸收分光度计测定其中钠、钾离子含量，结果如下(表1)：[0021] 表1 不同方法取得的伤流液量和伤流液中Na+、K+含量
[0022]
[0023] *表中同列不同字母间数值差异显著(P<0.05)
[0024] 结果显示，新方法(小部分破坏韧皮部收集棉花伤流液方法)获取伤流液的量略有下降，但未达显著水平，伤流液中Na+含量与常规方法相比显著下降。伤流液中K+含量变化不明显。因此，与常规方方法相比，新方法伤流液获取量略高于常规方法，但伤流液重Na+含量显著下降。说明微损伤方法中保留的大部分韧皮部对根系存在某种调节作用，而常规方法无法检测该调控作用。
[0025] 实施例2：
[0026] 取6株温室水培，两棵嫁接形成的具有一个头部，两个根部的嫁接分根的(参见发明专利ZL 201010190429.3)6片真叶棉株，茎基部直径为0.5cm的棉株。恢复2周后，在所有6株嫁接的棉花的一侧根系加入100mmol/L的氯化钠溶液，另一次加入正常营养液。处理6小时后取正常营养液一侧中生长的根系的伤流液，3株用常规方法，在基部1cm处切断茎杆，去掉头部，用去离子水冲洗切口3次，洗净后用准备好的脱脂棉(稀盐酸、蒸馏水、去离子水清洗，烘干，装入洁净的50ml Eppendorf管中待用)吸干切口内部和表面水分，取上述脱脂棉0.1g放在切口上，最后用5cm×5cm取样塑料袋套好，使脱脂棉与切口充分接触但不要太紧，用皮筋或线绳将塑料袋绑在下部棉秆上。3株用新方法(小部分破坏韧皮部收集棉花伤流液方法)取伤流液，取其伤流液方法如下：在茎基部一侧与茎平行用封口膜绑上一个长3cm，直径0.3cm的铁丝，固定点选择在铁丝的两端。在茎基部另一侧1cm处，用锋利刀片切除1/4周长，高度0.3cm的表皮、皮层、韧皮部和形成层，露出木质部。在露出木质部的两端用刀片将木质部切断，切口不能过深，以免破坏保留的韧皮部，用解剖针和刀片小心取出切断的木质部和髓，进
一步破坏剩余的木质部和髓并取出，注意保持下切面平整。先用去离子水冲洗切口内部3次，以除去破损细胞的溢出物，洗净后用准备好的脱脂棉吸干切口内部和表面水分，取上述脱脂棉0.1g放入切口，最后用封口膜将脱脂棉球和植株包扎
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