叶灵;姜长安
【摘 要】传统的线粒体分离技术,如差速离心和密度梯度离心不能有效应用于小规模高纯度的线粒体制备.为了提高线粒体纯化的速度和质量,我们尝试运用免疫沉淀法制备线粒体.通过用EGFP-4Flag融合蛋白来标记线粒体外膜,然后用单克隆Flag抗体和Protein G Agarose珠子做免疫沉淀,从培养的细胞中分离出高纯度的线粒体.这一简便高效的方法将有助于线粒体的生化研究. 【期刊名称】《四川动物》
【年(卷),期】2012(031)004
【总页数】4页(P541-544)
【关键词】线粒体纯化;稳定表达;外膜蛋白;免疫沉淀 【作 者】叶灵;姜长安
【作者单位】四川大学华西医院,生物国家重点实验室,成都610041;四川大学华西医院,生物国家重点实验室,成都610041
【正文语种】中 文
【中图分类】台阶轴Q939.91;Q78
Abstract:Traditional mitochondria isolation methods，such as differential centrifugation and gradient centrifugation，are not efficient in obtaining mitochondria from cultured cells．Here we have developed an alternative technique to purify mitochondria by immunoprecipitation．By labeling mitochondria with an outer membrane-targeted EGFP-4Flag fusion protein and pulling them down with monoclonal Flag antibody and Protein G agarose，we were able to isolate mitochondria of high purity from cultured cells．This simple and efficient technique will significantly optimize the biochemical studies of mitochondria．
Key words:mitochondria purification;stable expression;fusion protein;immunoprecipitation
线粒体不仅是细胞的能量代谢中心，也是细胞内许多重要生理过程，如细胞质Ca2+平衡、细胞凋亡、干扰素反应等不可或缺的调节位点(Dimmer＆Scorrano，2006)。近年来，大量的数据表明线粒体功能失调与许多疾病的发生发展直接相关，尤其是退行性神经疾病，因此线粒体的调节功能和作用机制已越来越成为当前生物医学研究的一个热点。
相对于遗传学和细胞生物学方面的研究，线粒体的生化研究目前还比较滞后。其中的主要技术瓶颈是难以高效率、高纯度地纯化线粒体。传统的线粒体纯化方法是通过破坏细胞膜，先以较低的离心力沉淀去除细胞核和细胞碎片，再以较高的离心力沉淀线粒体。这种粗提的线粒体一般纯度较低，含有不少细胞质蛋白甚至其他细胞器。用密度梯度离心作进一步纯化可以再提高纯度，但往往产率很低(Fernandez et al.，2006)。因此建立一种高效而廉价的线粒体纯化方法对线粒体的生化研究将有重要意义。
在本研究中，我们尝试用免疫沉淀的方法从培养的细胞中提取线粒体。先利用线粒体外膜蛋白USP30的定位序列将EGFP和Flag标签转运到线粒体外膜上，然后用单克隆Flag抗体和Protein G Agarose珠子将标记的线粒体从细胞匀浆中分离出来，从而获得高纯度的线粒体以用于下游的生化分析。
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1.1 主要材料与试剂
琼脂糖凝胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒均购自OMEGA BIO-TEK，各种限制性内切酶购自New England Biolabs，DMEM 培养基购自 Hyclone，胎牛血清购自 Biowest，蛋白酶抑制剂Cocktail、Dylight 680和Dylight 800标记的Western二抗购自Thermo Scientific，Flag单克隆抗体购自 Prospect公司，Protein G Agarose珠子购自Millipore，HEK293T细胞购自ATCC，其他生化试剂均为国产分析纯，pOTB7-USP30质粒购自Thermo Open Biosystems。
1.2 线粒体标签蛋白表达质粒的构建
USP30是线粒体外膜蛋白。已有的数据表明，USP30蛋白N-端的50个氨基酸是负责将它转运上线粒体外膜的信号序列(Ahting et al.，2005)。用PCR从pOTB7-USP30质粒扩增了USP30 ORF的前174个碱基(对应N-端的58个氨基酸)，两端引入酶切位点Acc65I和BamHI;同时用PCR扩增EGFP片段，两端引入酶切位点 BamHI和 XhoI;将 USP30(58)、EGFP的 PCR片段分别用 Acc65I/BamHI、BamHI/XhoI酶切，回收后同时连接入 pcDNA3.1(+)-4Flag载体的Acc65I和XhoI位点。转化到E.coli DH5α感受态细胞中，挑选阳
性克隆，提取质粒后酶切鉴定并测序，获得的重组质粒命名为pcDNA3.1(+)-USP30(58)-EGFP-4Flag。经瞬时转染确定能正常表达后，将 USP30(58)-EGFP-4Flag片段用Acc65I/PmeI从pcDNA3.1(+)-USP30(58)-EGFP-4Flag中切出，插入到Invitrogen慢病毒载体pLenti6中，获得pLenti6-USP30(58)-EGFP-4Flag。
1.3 慢病毒颗粒的包装
慢病毒的制备按照Invitrogen的ViraPower慢病毒表达系统的步骤。将HEK293FT细胞以50%的密度铺在10 cm培养皿中。当细胞密度达到90%左右时，同时转染 pLenti6-USP30(58)-EGFP-4Flag以及包装载体 pLP1、pLP2、pLP-VSVG。转染 4～6 h后，换成含10%FBS的DMEM培养液。40 h后收集含有慢病毒颗粒培养液，分管速冻后保存在－80℃。
1.4 稳定表达细胞的筛选
在24孔板中铺HEK293T细胞，密度为50%左右，贴壁后加入慢病毒原液感染，4～6 h后换液;细胞长到90%密度时将其消化并接种到6孔板中，12 h后加入10 μg/mL Blasticidin S进
行筛选。大约一周后细胞克隆集落长满，再将筛选好的细胞消化接种到10 cm培养皿中，以2 μg/mL Blasticidin S维持培养。
1.5 标签蛋白的表达和定位
细胞免疫荧光染:4%多聚甲醛固定细胞15 min;0.1%Triton X-100对细胞进行透化处理15 min;含5%BSA的PBST室温封闭1 h;一抗Tomm20 4℃孵育过夜;相应二抗室温避光孵育1 h;DAPI染细胞核5 min;90%甘油封片。荧光显微镜观察细胞株中融合蛋白的表达及定位。
Western Blot分析:以1×106cells/mL加入蛋白上样缓冲液(2%SDS，2 mM DTT，4%甘油，40 mM Tris-HCl，pH6.8，0.01%溴酚蓝)，100℃煮样 5 min。样品用12%的分离胶分离后转移至PVDF膜。含5%脱脂奶粉的PBST封闭1 h，抗Flag或EGFP单抗4℃孵育过夜，PBST洗膜，二抗孵育后用Li-Cor Odyssey红外激光成像系统成像。
1.6 线粒体提取及检测
取10 cm培养皿中密度为100%的细胞，弃培养液，加预冷的PBS pH7.4洗两遍，将细胞收集到1.5 mL EP管中;加600 μL含蛋白酶抑制剂Cocktail的PBS重悬细胞，超声破碎细胞，在电火花切割机床
4℃ 1000 g离心10 min;将上清转移到新的EP管中，加Flag抗体，4℃旋转结合2 h;加Protein G-Agarose结合1 h;低速离心，弃上清，PBS洗3次;加入蛋白上样缓冲液，进行SDS-PAGE。
2.1 pcDNA3.1(+)-USP30(58)-EGFP-4Flag质粒鉴定结果
重组质粒经Acc65 I和Xho I双酶切后，获得大小约1 kb的目的片段条带和5.5 kb的载体条带，与预期相符(图1，B)。经测序鉴定，插入序列完全正确。结构图如图1，A。
2.2 稳定表达细胞株的建立及荧光观察和表达结果
病毒原液感染HEK293细胞，经Blasticidin S筛选10 d左右，获得稳定表达的细胞株。荧光显微镜下可见绿荧光信号位于线粒体上，有表达的细胞占总细胞数的70%左右。细胞经培养3周后，仍能够检测到绿荧光信号(图2)。免疫荧光染表明绿EGFP信号与线粒体外膜蛋白Tomm20的红荧光信号高度重合，说明外源标签蛋白在HEK293细胞中获得了稳定表达，并且定位在线粒体外膜上。
HOST 格式Western blot验证筛选所获得稳定表达细胞中USP30(58)-EGFP-4Flag蛋白的表达，分别以
抗EGFP和抗Flag为一抗，以未转染的HEK293细胞作为阴性对照。结果显示，筛选得到的稳定细胞株可表达USP30(58)-EGFP-4Flag融合蛋白，分子量大小相符(图3)。
2.3 线粒体纯化结果
核桃脱壳机
用Flag抗体做免疫沉淀，从USP30(58)-EGFP-4Flag细胞株中纯化了线粒体。用离心法制备的HEK293T线粒体为对照，用Western blot确定了所得线粒体的纯度，其中Tomm40为线粒体标记，β-actin为细胞骨架标记，GAPDH为细胞质标记。结果显示，传统离心法得到的线粒体可检测到Tomm40，也可检测到大量β-actin，说明所得到的线粒体含有相当高的细胞质蛋白污染。免疫纯化法得到的线粒体中β-actin量显著减少，说明它的纯度比用常规的离心方法分离的线粒体高得多(图4)。
自从1948年George和他的同事根据细胞中各组分沉降速率不同的特性，用差速离心法成功地分离了线粒体以后(Hogeboom et al.，1948)，这一技术突破在线粒体研究领域发挥了里程碑的作用。在此后的20多年里，各种研究成果源源不断，包括线粒体能量生成机制(Mitchell＆Moyle，1967)、线粒体中遗传物质DNA发现(Nass＆Nass，1963;Schatz et al.，1964)、线粒体超微结构研究(Palade，1952)、线粒体内膜通道的发现(Sorgato et al.，
1987)、线粒体蛋白膜内运输途径(Hallermayer et al.，1977)等。20世纪90年代以后，发现线粒体通过释放细胞素C和膜间隙蛋白促进细胞凋亡、神经元形态的构建和重塑以及病毒引起的干扰素反应等(Liu et al.，1996;Yang et al.，1997)。大量证据也表明线粒体在一些疾病的发生发展中扮演了重要角。目前已发现与线粒体失调直接相关的退行性神经疾病就有近20种(Bossy et al.，2003)。这些发现表明线粒体广泛地参与了各种生理过程。
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