免疫荧光（Immunofluorescence,IF）实验⽅法步骤详解 免疫荧光技术（Immunofluorescence technique ）⼜称荧光抗体技术，是标记免疫技术中发展最早的⼀种。它是在免疫学、⽣物化学和显微镜技术的基础上建⽴起来的⼀项技术。很早以来就有⼀些学者试图将抗体分⼦与⼀些⽰踪物质结合，利⽤抗原抗体反应进⾏组织或细胞内抗原物质的定位。它是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光基团，再⽤这种荧光抗体（或抗原）作为探针检查细胞或组织内的相应抗原（或抗体）。利⽤荧光显微镜可以看见荧光所在的细胞或组织，从⽽确定抗原或抗体的性质和定位。 ⼀、基本原理：
免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再⽤这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利⽤荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射⽽发⽣明亮的荧光（黄绿⾊或橘红⾊），可以看见荧光所在的组织细胞，从⽽确定抗原或抗体的性质、定位，以及利⽤定量技术测定含量。
⼆、应⽤范围：
其应⽤范围极其⼴泛，可以测定内分泌激素、蛋⽩质、多肽、核酸、神经递质、受体、细胞因⼦、细胞表⾯抗原、肿瘤标志物、⾎药浓度等各种⽣物活性物质。根据诊断类别，⼜可分为传染性疾病、内分泌、肿瘤、药物检测、免疫学、⾎型鉴定等。
三、基本实验步骤：风机盘管电机
1、细胞准备。对单层⽣长细胞，在传代培养时，将细胞接种到预先放置有处理过的盖玻⽚的培养⽫中，待细胞接近长成单层后取出盖玻⽚，PBS洗两次；对悬浮⽣长细胞，取对数⽣长细胞，⽤PBS离⼼洗涤（1000rpm,5min）2次，⽤细胞离⼼甩⽚机制备细胞⽚或直接制备细胞涂⽚。
2、固定。根据需要选择适当的固定剂固定细胞。固定完毕后的细胞可置于含叠氮纳的PBS中4℃保存3个⽉。PBS洗涤3×5 min.
3、通透。使⽤交联剂（如多聚甲醛）固定后的细胞，⼀般需要在加⼊抗体孵育前，对细胞进⾏通透处理，以保证抗体能够到达抗原部位。选择通透剂应充分考虑抗原蛋⽩的性质。通透的时间⼀般在5-15min.通透后⽤PBS洗涤3×5 min.
4、封闭。使⽤封闭液对细胞进⾏封闭，时间⼀般为30min.
5、⼀抗结合。室温孵育1h或者4℃过夜。PBST漂洗3次，每次冲洗5min.
6、⼆抗结合。间接免疫荧光需要使⽤⼆抗。室温避光孵育1h.PBST漂洗3次，每次冲洗5min后，再⽤蒸馏⽔漂洗⼀次。
7、封⽚及检测。滴加封⽚剂⼀滴，封⽚，荧光显微镜检查。
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四、注意事项：
1、染完之后没有封⽚前直接照⼀些，因为有的时候可能封⽚会出现问题，再想照反⽽没有了，另外不要拖太长时间，荧光会崔灭的。
2、荧光的⽚⼦⼀定要避光保存，保存的好的话，过⼀段时间仍然能照出很好的⽚⼦。
3、⼆抗⽤之前⼀定离⼼，不然有的时候有那种沉淀，在⽚⼦上就是⼀个很⼤的⾮特异性荧光光点，⾮常难看。
4、整个操作在4℃下进⾏，洗涤液中加有⽐常规防腐剂量⾼10倍的NaN３，上述实验条件是防⽌⼀抗结合细胞膜抗原后发⽣交联、脱落。
5、洗涤要充分，以避免游离抗体封闭⼆抗与细胞膜上⼀抗相结合，出现假阴性。
6、加适量正常兔⾎清可封闭某些细胞表⾯免疫球蛋⽩Fc受体，降低和防⽌⾮特异性染⾊。
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7、细胞活性要好，否则易发⽣⾮特异性荧光染⾊。抗淬灭剂可拿来直接封⽚,20微升即可，之后⽚⼦可保留更长时间。
五、荧光物质：
1、荧光⾊素
许多物质都可产⽣荧光现象，但并⾮都可⽤作荧光⾊素。只有那些能产⽣明显的荧光并能作为染料使⽤的有机化合物才能称为免疫荧光⾊素或荧光染料。常⽤的荧光⾊素有：
(1)异硫氰酸荧光素（fluoresceinisothiocyanate，FITC）为黄⾊或橙黄⾊结晶粉末，易溶于⽔或酒精等溶剂。分⼦量为389.4，最⼤吸收光波长为490--495nm，最⼤发射光波长520--530nm，呈现明亮的黄绿⾊荧光，有两种同分异结构，其中异构体Ⅰ型在效率、稳定性、与蛋⽩质结合能⼒等⽅⾯都更好，在冷暗⼲燥处可保存多年，是应⽤最⼴泛的荧光素。其主要优点是：①⼈眼对黄绿⾊较为敏感，②通常切⽚标本中的绿⾊荧光少于红⾊。
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(2)四⼄基罗丹明（rhodamine，RIB200）为橘红⾊粉末，不溶于⽔，易溶于酒精和丙酮。性质稳定，可长期保存。最⼤吸收光波长为570nm，最⼤发射光波长为595～600nm，呈橘红⾊荧光。
(3)四甲基异硫氰酸罗丹明（tetramethylrhodamineisothiocyanate，TRITC）
最⼤吸引光波长为550nm，最⼤发射光波长为620nm，呈橙红⾊荧光。与FITC的翠绿⾊荧光对⽐鲜明，可配合⽤于双重标记或对⽐染⾊。其异硫氰基可与蛋⽩质结合，但荧光效率较低。
2、其他荧光物质
（1）酶作⽤后产⽣荧光的物质某些化合物本⾝⽆荧光效应，⼀旦经酶作⽤便形成具有强荧光的物质。例如4-甲基伞酮-β-D半乳糖苷受β-半乳糖苷酶的作⽤分解成4-甲基伞酮，后者可发出荧光，激发光波长为360nm，发射光波长为
450nm。其他如碱性酸酶的底物4-甲基伞酮磷酸盐和辣根过氧化物酶的底物对羟基苯⼄酸等。
（2）镧系螯合物某些3价稀⼟镧系元素如铕（Eu3 ）、铽（Tb3 ）、铈（Ce3 ）等的螯合物经激发后也可发射特征性的荧光，其中以Eu3 应⽤最⼴。Eu3
螯合物的激发光波长范围宽，发射光波长范围窄，荧光衰变时间长，最适合⽤于分辨荧光免疫测定。
六、常见荧光素的特性：
1、FITC：黄⾊结晶粉末，吸收光：490~495nm，发射光：520~530nm，明亮的黄绿⾊荧光。
2、RB200：橘红⾊粉末, 吸收光570nm，发射光 595~600nm，橘红⾊荧光。36xp
3、TRITC：紫红⾊粉末，吸收550nm，发射光 620nm，橙红⾊荧光。
4、镧系：Eu、Tb碎花刀刀
5、PE：吸收光490~560nm，发射光 595nm，红⾊荧光。
6、其它：酶作⽤后产⽣荧光物质。
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