ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程

ELISA方法确定制备抗体效价的标准操作规程（编号：033）水泥胶砂试模

1、目的及适用范围

该SOP用于规范利用ELISA方法检测制备抗体的标价的操作。

2、主要仪器及试剂

防粘贴离心机、冰箱、37℃恒温箱、酶标仪、洗板机、包被缓冲液、洗涤缓冲液、封闭液、0.2M Na2HPO4、0.1 M 柠檬酸、0.1 M EDTA、A、B底物反应液、终止液、HRP标记二抗（ELISA效价1:10000-100000）3、操作步骤

3.1 目的蛋白的纯化；

3.2 免疫兔子或小鼠；

3.3 采集免疫动物的血清；

金属石墨垫片3.4 抗原包被，每孔包被抗原50-200ng，4℃包被过夜或37℃包被5h；

3.5 用封闭液37℃封闭3h或4℃封闭过夜，然后用PBST洗涤3次，每次2min；

3.6 将抗体（免疫血清）和阴性血清分别按1:1000，1:2000，1:5000，1:10000和1:50000稀释后，每孔加入50μL，37℃温育45min，用PBST洗涤5次；

空气净化加湿器3.7 加入相应的HRP标记二抗，37℃温育30min，用PBST洗涤5次；

3.8 每孔分别加入50μL A液和B液，然后每孔加入50μL终止液；

3.9 测定其A450nm，如果样品孔与阴性对照孔A450nm比值大于2.1最高稀释倍数为抗体效价。

3.10 抗体效价评定：一般来说，用重组蛋白作为抗原免疫动物所得到的免疫血清，其ELISA效价应不低于1:5,000。为了能更充分验证制备抗体的效价及特异性，最好是联合Western-blot及IFA 等方法一起来检测制备抗体的效价及特异性。

4、注意事项

4.1免疫抗原选择要点

4.1.1尽量选择标签比较小的载体来纯化目的蛋白，而且在克隆目的基因时尽量去除载体序列。如可以选择PET-30a载体(His标签)作为表达载体时，尽量选择Nde I/Xho I这两个酶切位点来克隆目的基因。

管坯

摄像机三脚架4.1.2重组蛋白纯度应不低于90％。一般来说，纯度在90％以上的蛋白，取10μg电泳，在SDS-PAGE 胶上应基本看不到杂带。

本文发布于:2024-09-21 19:54:14，感谢您对本站的认可！

标签：抗体效价制备免疫蛋白载体

留言与评论（共有 0 条评论）