第一天：
1. 红薯清洗机在培养板中将已爬好细胞的玻片用 PBS 浸洗 3 次，每次 3min ； 2.用 4% 勺多聚甲醛固定爬片 15min , PBS 浸洗玻片 3 次，每次 3min ；
3.0.5%Triton X-100 （ PBS 配制 ）室温通透 20min （细胞膜上表达的抗原省略此步骤）；
4.PBS 调漆设备浸洗玻片 3 次，每次 3 min ，吸水纸吸干 PBS 在玻片上滴加正常山羊血清，室温封闭 30min ； 5.吸水纸吸掉封闭液，不洗，每张玻片滴加足够量的稀释好的一抗并放入湿盒，
4 C 孵育过夜；
第二天：
ddtsf
6. 加荧光二抗： PBST 浸洗爬片 3 次，每次 3min , 吸水纸吸干爬片上多余液体 后滴加稀释好的荧光二抗，湿盒中 20-37 C 孵育 1h，PBST 浸洗切片 3 次，每次 3mi n；注意：从加荧光二抗起，后面所有操作步骤都尽量在较暗处进行。
7.复染核：滴加 DAPI 避光孵育 5min , 对标本进行染核， PBST 5min X 4 次洗去 多
余的 DAPI;8. 用吸水纸吸干爬片上的液体，用含抗荧光淬灭剂的封片液封片， 然后在
荧光显微镜下观察采集图像。
细胞免疫荧光步骤
1.在 24 孔板里加 500 微升培养基，放爬片，接种细胞（做实验以 | 30-50% 汇合 |
| |
度较好。 10000-30000 左右 2.给药处理 24h 。 3.PBS 洗三遍。
4.4 %冷的多聚甲醛固定 15 分钟， PBS 洗三遍，每次 5min ，摇床。（避光） 5.0.5 %
Triton X — 100 （晶闸管调压器PBS 配）破膜 15min ，PBS 洗三遍，每次 5min ，摇床。
6.5%BSA
（牛血清白蛋白， PBS 配）封闭 60 分钟 ，不用洗。 7.加一抗孵育（ 5%BSA 配），
4 C 摇床过夜。
8.收集一抗， PBS 洗三遍，每次 5min ，摇床。孵育二抗 Alexa Fluor 488 （1:1000 ）, 室温 60min （避光）
9.回收二抗， PBS 洗三遍，摇床，每次 5min 。
10.0.5ug/mLDAPI ( 5%BSA 配， 2 滴/ml) 染核 15min 。( 避光 )
11.PBS 洗三遍，每次 5min ，摇床。
12. 取载玻片，滴加 10uL 抗荧光衰减封片剂，将爬片有细胞面盖在封片剂上 , 指甲
油封片子的对角线。
All steps for IF
1)Remove culture medium and fix cells (a com mon fixative is 4% formaldehyde in PBS, for 15 min utes)
2)Wash well in PBS (3 x 5 minutes is typical)
3)Permeabilize the cells (a com mon permeabilizati on reage nt is 0.2% Trito n X-100 in PBS for 30 mi nutes)
4)Wash well in PBS
5)(opti on al: Block for non-specific dye binding using the Image-iT FX Imag e En ha ncer Solutio n, 136933)
6)Block for non-specific an tibody bin di ng 30-60 mi nu tes (a com mon blocki n g solution would be 3-6% bovine serum albumin / 5% normal goat serum / PB S, or comme
rcial block ing reage nts like our BlockAid, product B10710)
7)Incubate in primary antibody for 30-60 minutes, in blocking solution or ov erni ght at 4 degrees (an tibody concen trati ons vary, but usually betwee n 0.5-1
0ug/mL)
8)Wash well in PBS
9)Incubate in secondary antibody for 30-60 minutes, in 3-6% bovine serum
转底炉albumin / PBS (a good starting antibody concentration is 5 ug/mL) 10) Wash well in
PBS
11)Counterstain as needed (such as with DAPI, D1306)
12)Mount in appropriate mounting medium (for fluorescent secondaries, a go od antifade
solution is best, such as ProLong Gold, P36934, or SlowFade Gol d, S36937)
（专业文档是经验性极强的领域， 无法思考和涵盖全面， 素材和资料部分来自网络，供参考。可复制、编制，期待你的好评与关注）
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