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间接ELISA实验设计

一．间接 ELISA 检测方法的建立-----用方阵法确定抗原最佳工作浓度，阴、阳性血清最佳稀释度，酶标二抗最佳稀释度

需要的试剂与器材：

①纯化的病毒液

②阳性（小鼠第三次免疫时的血清）和阴性血清（未免疫的阴性小鼠血清）

③ 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6

④0.5% BSA 封闭液

⑤PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20) 洗液

⑥HRP 标记的羊抗鼠 IgG(HRP-IgG)

⑦l2mol/LH2SO4终止液

⑧底物显液邻苯二胺(OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液)

⑨96孔酶联板，酶标仪

用四个96孔板做实验，加入的羊抗鼠HRP-IgG稀释度分别为1：2000,1:4000,1:8000,1:16000.

1=1:1600阴性血清

2=1:800阴性血清

3=1:400阴性血清

4=1:200阴性血清

5=1:100阴性血清

1=1:1600阳性血清

2=1:800阳性血清

3=1:400阳性血清

4=1:200阳性血清

5=1:100阳性血清

12=100ulPBST

A=50ug/ml病毒抗原

B=40ug/ml病毒抗原

C=30ug/ml病毒抗原

D=20ug/ml病毒抗原

E=10ug/ml病毒抗原

F=5ug/ml病毒抗原

1.用 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6，将病毒稀释成 50 µg/mL、40 µg/mL、30 µg/mL、20 µg/mL、10 µg/mL、5 µg/mL 6 个浓度梯度，分别包被 96孔酶联板 A~F 行， 100µl/ 孔， 4 ℃ 放置过夜，次日，用洗液PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20) 洗板 3 次，每孔加入 100µl 0.5% BSA 封闭液，37℃封闭 1 h，PBST 洗板 3 次；

2.分别加入阳性和阴性血清，阳性血清和阴性血清分别做 1:100、1:200、1:400、1:800 和 1:1600 倍比稀释，37℃孵育 1 h，弃一抗，PBST 洗板 3 次；

3.每孔加入 100 µl 1:2000/1:4000/1:8000/1:16000 稀释的 HRP 标记的羊抗鼠 IgG(HRP-IgG)，37℃孵育 1 h，弃二抗，PBST 洗板 3 次后，每孔加入 50µl底物显液邻苯二胺(OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液)，37℃避光显 15 min 后，每孔加入 50µl2mol/LH2SO4进行终止。（如果显效果不理想，可以考虑分别用10,15,20min显）

4.随后在酶标仪上读取 OD490值，选择阴性血清孔(N)的 OD 值<0.2、阳性血清孔(P)的值数控机床数据采集

>1.0、P/N>2.1 的抗原抗体最大稀释度为最佳工作浓度。（所有的OD值先减去PBST孔的OD值进行调零）

二．对三次免疫后的小鼠血清效价进行检测，选取效价较高者加强免疫

需要的试剂与器材：

①纯化的病毒液

②阴性血清（未免疫的阴性小鼠血清）

③ 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6

④0.5% BSA 封闭液

⑤PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20) 洗液

⑥HRP 标记的羊抗鼠 IgG(HRP-IgG)

⑦l2mol/LH2SO4终止液

⑧底物显液邻苯二胺(OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液)

⑨96孔酶联板，酶标仪

血清稀释度（1：X）

血清号

1000 2000 4000 8000 16000 32000 64000

蚊子网4

阴性

1.纯化抗原用包被液稀释至已确定的最佳工作浓度

2.以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

3.弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干

4.每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时

5.洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用

6.每孔加适量免疫小鼠血清（倍比稀释），同时设立阴性对照（阴性对照血清为已确定的最佳稀释度）；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干

6.加酶标第二抗体，每孔100ul，稀释度为已确定的最佳稀释度，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干

7.加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃30分钟

8.以2mol/L H2SO4终止反应

9.在酶联免疫阅读仪上读取OD值

三．间接ELISA筛选杂交瘤细胞阳性克隆株

杂交瘤细胞在融合后2周左右即可筛选，即把分泌所需抗体的杂交瘤孔从众多的孔中选出来，通常也称为抗体检测。融合10d换液后,待杂交瘤细胞生长至培养孔1/10或者培养上清变黄时,吸取待检孔上清100uL加入检测板孔中.

需要的试剂与器材：

①纯化的病毒液

②阳性（小鼠第三次免疫时的血清）和阴性血清（未免疫的阴性小鼠血清）

③ 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6

④0.5% BSA 封闭液

⑤PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20) 洗液

⑥HRP 标记的羊抗鼠 IgG(HRP-IgG)

⑦l2mol/LH2SO4终止液

⑧底物显液邻苯二胺(OPD、稀释液为柠檬酸缓冲液)

⑨96孔酶联板，酶标仪

拉挤模具6

a+b1+c

a+b2+c

a+b3+c

a+b4+c

a+b5+c

a+b6+c

a+b7+c

a+b8+c

a+b9+c

a+d+c

a+e+c

a+f+c

a+b10+c

a+b11+c

a+b12+c

a+b13+c

a+b14+c

a+b15+c

a+b16+c

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a+b18+c

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a+b19+c

a+b20+c

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a+b22+c

a+b23+c

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a+b25+c

a+b26+c

a+b27+c

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a+b28+c

a+b29+c

a+b30+c

a+b1+c

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a+b33+c

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a+b35+c

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a+b36+c

a+b37+c

a+b38+c

a+b39+c

羽绒睡袋a+b40+c

a+b41+c

a+b42+c

a+b43+c

a+b44+c

a+d+c

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a+b45+c

a+b46+c

a+b47+c

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a+b49+c

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a+b54+c

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a+b57+c

a+b58+c

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a+b61+c

a+b62+c

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a+b63+c

a+b64+c

a+b65+c

a+b66+c

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a+b68+c

a+b69+c

a+b70+c

a+b1+c

a+d+c

a+e+c

泰尹网wiy5a+f+c

a=最佳工作浓度的纯化抗原; b=100ul杂交瘤细胞培养液上清; c=最佳稀释度酶标二抗； d=PBST空白对照； e=最佳稀释度阴性血清； f=最佳稀释度阳性血清

1纯化抗原用包被液稀释至已确定的最佳工作浓度

2.以100ul/孔量加入酶标板孔中，置4℃过夜或37℃吸附2小时。

3弃去孔内的液体，同时用洗涤液洗3次，每次3-5分钟，拍干

4每孔加200ul封闭液4℃过夜或37℃封闭2小时

5.洗涤液洗3次；此时包被板可-20℃或4℃保存备用

6.每孔加100ul待检杂交瘤细胞培养上清，同时设立阳性、阴性对照（阳性、阴性对照血清为已确定的最佳稀释度）和空白对照；37℃孵育1-2小时；洗涤，拍干

7.加酶标第二抗体，每孔100ul，稀释度为已确定的最佳稀释度，37℃孵育1-2小时，洗涤，拍干

8加底物液，每孔加新鲜配制的底物使用液100ul，37℃30分钟

9以2mol/L H2SO4终止反应

10.在酶联免疫阅读仪上读取OD值。

结果判定：待检孔的OD值/阴性孔的OD值≥2.1即可判为阳性。若阴性对照孔无或接近无，阳性对照孔明确显，则可直接用肉眼观察结果。

筛选出的阳性克隆株以有限稀释法进行培养，待杂交瘤细胞生长至培养孔1/10或者培养上清变黄时,吸取待检孔上清100uL加入检测板孔中，再次进行抗体检测，重复四次左右，直至所有孔的阳性率达到100%。

四．间接ELISA检测杂交瘤细胞阳性株培养液上清，腹水抗体效价

认证机构管理系统筛选出的阳性克隆株培养上清，吸取100ul按1:1,1:2,1:4,1:8,1:16，1:32,1:64,1:128两倍倍比稀释。

腹水先做1:100稀释，再做1:1,1:2,1:4,1:8,1:16，1:32,1:64,1:128两倍倍比稀释。

需要的试剂与器材：

①纯化的病毒液

② 0.05mol/L 的碳酸盐缓冲溶液，PH=9.6

③ 0.5% BSA 封闭液

④ PBST(PH=7.4,0.01mol/LPBS，0.05%Tween-20) 洗液

本文发布于:2024-09-21 19:52:07，感谢您对本站的认可！

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