Western Blot检测 SOP
1目的为了使抗体部生产活动正常进行，特制定本规程。
2 范围适用于Western Blot检测工作人员的生产活动。
3 责任生产部门组织制定和实施，行政部负责监督。
4 程序
4.1 WB检测原理
蛋白质印迹(Western blot)，是根据抗原抗体的特异性结合检测复杂样品中的某种蛋白的方法。WB采用的是聚丙烯酰胺凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗
体起反应，经过底物显或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。
4.2 WB检测小组的工作内容
4.2.2 小鼠血清阳性的WB检测
4.2.3 融合后的杂交瘤细胞株单阳性的WB检测
4.2.4 每次亚克隆后细胞株单阳性的WB检测
4.2.5 小鼠腹水阳性的WB检测
4.2.6 多抗生产中，兔血清的WB检测
4.3 细胞和组织裂解液制备标准流程
4.3.1 贴壁细胞: 去除培养基，用冰冷的的PBS洗三次，6孔板加50-100ul EBC
裂解液，直径10cm平皿或25cm2(T25)培养瓶加200-400ul裂解液，一般
测试机器人
加200ul合适，用细胞刮使裂解液与细胞充分接触（通常裂解液接触细
胞1-2秒后，细胞就会裂解），再将刮下的裂解液收集于离心管中。
4.3.2 悬浮细胞:离心收集细胞，用冰冷的PBS洗三次，每次5ml左右，用手
指轻弹收集细胞管管壁，使细胞均匀散开，1000-2000rpm离心根据细胞
回生电阻压积每100ul加1ml裂解液，再用手轻弹细胞管管壁，使裂解液与细胞
充分接触，以便于充分裂解细胞。
保密文件
4.3.3 组织：分析天平准确称取组织，将组织用PBS清洗干净，按照1g组织
加10ml裂解液（Tissue lysis buffer）的比例加入适量裂解液并将组织剪
碎，转移到玻璃匀浆器中，研磨10~20min，直到将组织充分磨碎，将研
磨液转移到离心管中。
4.3.4 将收集出来的裂解液于冰浴(冰盒)中置摇床上孵育2小时，待细胞充分
裂解后，13000rpm离心15min，小心取上清（避免残渣和脂肪），重复
一次（除尽残渣，残渣内含大量DNA,RNA）加入6x loading buffer（上
样缓冲液），煮沸(5-10min)，分装，于-80℃冰箱长期贮存。（一般可贮存
1-2年）
4.3.5 蛋白定量与质控，采用酶标仪定量，然后蛋白电泳考马斯亮蓝染观察
条带是否清晰，有拖带或条带不完整的应丢弃。根据电泳也可目测蛋白
浓度。
4.4 WB检测标准流程
4.4.1制备SDS-PAGE胶
视蛋白分子大小来选择不同的胶浓度，通常为6%-12% （分子量5-20KDa用双层Tricine-SDS-PAGE小于5KDa用三层
Tricine-SDS-PAGE<一般不用>配方见下表）；分子量15-30KDa，15%
SDS-PAGE；分子量30-90KDa ，12% SDS-PAGE；分子量60-120KDa ，10% SDS-PAGE；分子量90-120KDa，8% SDS-PAGE；分子量大于
120KDa，6% SDS-PAGE）比例配制分离胶，加入异丙醇封闭，静置
10-20min（视温度而定，一般手指轻压短玻板，液面肉眼不见上升即聚
合。室温15min已聚合，37℃<10min聚合）使之充分聚合。用滤纸吸
净异丙醇，按积层胶比例配方配制积层胶，插上梳子，静置10-20min（室
温10min，37℃5min）使之充分聚合，待用。
4.4.2SDS-PAGE电泳
电力电子电容器
樱桃采摘机将胶安装在电泳槽中后倒入电泳缓冲液，静置3-5min检查是否漏液。上样（Marker一般上5ul左右，细胞裂解液10-20ul）重组抗原
40-80ng/lane，细胞裂解液每个泳道多少40ug。电泳电压、时间视目的蛋
白的大小选择不同的电泳电压90V 30min使之电泳至分离胶然后用150V
45min电泳，溴酚兰至胶底，Marker完全分开。
4.4.3转膜
爆震弹湿转仪：PVDF膜用甲醇浸泡3-5min，浸泡至PVDF膜完全浸透，呈半透明状，再用转膜缓冲液浸泡3-5min，取出时不再疏水，膜表面液
体不成股流下，而是均匀分布，无水珠，滤纸和纤维垫均用转膜缓冲液
浸透。转膜时按照从阳极到阴极的顺序：纤维垫、滤纸、膜、胶、滤纸、纤维垫。
超分散剂应用涂料工业注意膜胶和滤纸之间均不能有气泡。夹紧装至电泳槽。转膜电压、时间视目的蛋白的大小选择适当转膜电压（分子量小于60Kda，
90V50min；分子量60-120KDa，90V70min；分子量120-180KDa，90V,
时间90min；分子量大于180KDa，90V120min）、冰浴转膜。分子量130kd
以上通常选半干转印23v25min。
半干转印仪：PVDF膜用甲醇浸泡3-5min，再用转膜缓冲液浸泡3-5min，滤纸和纤维垫均用转膜缓冲液浸透。转膜时按照从阳极到阴极
的顺序：厚滤纸、膜、胶、厚滤纸。注意膜胶和滤纸之间均不能有气泡。
(按照1.5mA/cm2转15-20min或小分子>30KDa ，24V 18min 大分子
根据凝胶浓度适当延长时间)
4.4.4 染步骤（可选）
4.4.4.1 洗膜3次，每次5min，轻摇
4.4.4.2 放入氨基黑染液中染30sec，轻摇
4.4.4.3 在脱缓冲液中脱，换液几次，轻摇，直到蛋白条带清晰而背景变
白。
4.4.4.4 如果马上使用膜，保持膜的湿润。也可干燥后常温下放置一年。干燥
的膜使用前浸泡甲醇。
4.4.4.5封闭
用PBST配制5%的脱脂奶粉（封闭液），每张膜加50ml左右封闭液，根据时间安排选择放入电热恒温箱么37℃摇动封闭1-2h，或4℃过夜。
一抗孵育
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