Western Blot protocol
1). 30%丙烯酰胺：
将29g丙烯酰胺和1g N，N’-亚甲双丙烯酰胺溶于总体积为100ml的水中。搅拌器帮助溶解，滤纸过数控剪床滤除杂质，避光保存于4度冰箱。
2). 10% SDS：
称量10g十二烷基硫酸钠，加入80ml超纯水中，加热搅拌溶解，加水至100ml室温保存备用。
、188g甘氨酸、10gSDS、加水至1000ml
4).20×转膜缓冲液：
Tris 29g，Glycine 144g，SDS 2g 加水定容至1000ml
配制1×转膜缓冲液200ml (甲醇 40ml，20×transfer buffer 10ml，H2O 150ml)
5). Tris ： （注意温度对tris PH值的影响）
g Tris 溶于80ml超纯水中，加浓盐酸调PH值，定容至100ml。
·
高温灭菌后室温保存。
6).1M Tris ：
Tris 溶于80ml 超纯水，加浓盐酸调PH值，定容至100ml。
高温灭菌后室温保存。
7). 10×PBS：
NaCl 80g，KCl BIFEI2g， ，KH2PO4 ，用盐酸调PH至，加水定容至1000ml
8). 1xPBST% Tween 20)：
10×PBS 100ml，H2O 900ml， Tween 20 50ul
9).10%（W/V）过硫酸铵：
临时配，过硫酸铵溶于1ml 超纯水，4度冰箱保存3天
10). 丽春红染液储存液%（W/V）丽春红，5%（V/V）乙酸)：
，丽春红，冰醋酸2ml，超纯水 38ml
》
11). 封闭液：
5%（W/V）脱脂奶粉溶于1X PBST 中，使用时现配。
12) Stripping buffer (BME 800ul，SDS 2g，脱模剂原料TRIS ，HCl调pH至，加水定容至100ml)
操作mcu解密步骤
1.蛋白制备：10CM细胞平板，90%满度。弃培基，用5ml PBS清洗一遍，加入1 ml PBS用细胞刮将细胞挂下，移入2 ml EP管中，（将平板对光观察， 可以判断细胞刮下的完全度），可以用1ml PBS清洗一遍，将清洗液一并转入2ml EP管中。4000rmp离心1分钟。弃上清，以100ul PBS重悬沉淀，加入100ul 2×loading buffer。将EP管置于金属浴中99℃处理10min（热处理管盖会崩开，在管盖上压一个重物）。置于冰上准备上样，或是-20度保存。按照之前的蛋白定量结果，10cm平板大约能提取450-600ug蛋白。
2.配胶和上样电泳
1).配胶前先将玻璃板、梳子和电泳仪等洗干净，并将玻璃板晾干。
2). 根据所检测蛋白的大小并参照表1选择丙烯酰胺的浓度，再根据表2配方配制分离胶。配制分离胶时要混合均匀并缓慢加入玻璃板里，注意分离胶与加样孔底间要留出1cm左右积层胶，用异丙醇封胶面。 提拉下水
表1
】 丙烯酰胺浓度（%） | 线性分离范围（kD) |
15 | 12-43 |
10 | 16-68 |
| 36-94 |
5 | 57-212 |
| |
^
表2 （一块胶的用量）
| 分离胶 | 积层胶 |
| 8% | ] 10% | 12% | 15% | 5% |
ddH2O | | | | | |
30% PAGE | | | | | | |
| （ tris ） | （1 M tris ） |
10%SDS | " | |
10% AP | | |
TEMED | | |
总体积 | 5ml | 2ml |
| | | | | |
！
待分离胶凝后（约需15-30min，根据室内温度），倒掉ddH2O后，用滤纸条吸干水分。参照表2配制积层胶，到积层胶时尽量倒满（如果有些漏要及时补胶），插梳子前保证梳子的清洁。拔梳前，需要用刀片沿梳和玻板间隙划一次以除去玻璃板外的胶。待积层胶凝固后拔掉梳子，这时，若发现有上样孔歪斜，可以用注射器针头将上样孔调整好，之后将胶版装上电泳槽后，加上电泳缓冲液后待用，清洗时避免槽间隔异位。
3). 样品上样：蛋白样品临上样前，13000rpm、1分钟高速离心，上样时取上清。80V电压跑浓缩胶，120V跑分离胶。参考marker条带，到相应位置时停止电泳。 上样品左右两边如果有空余泳道，可加等体积的1×上样缓冲液，这样跑出来的胶好看。
2.转膜（半干转，整个连供系统操作中戴手套，不要用手触膜）
①在电泳过程中，剪好与分离胶等大的滤纸10张和PVDF膜1张（国产电泳仪分离胶大小约为×）；配transfer buffer (20 ml 5×transfer buffer，20ml甲醇，加水至100ml)；先在容器中加入适量甲醇，放入PVDF膜（可切角帮助标记正反面），浸泡30s-1min后转移到转膜液中待用。然后将PVDF膜和滤纸每五张一起叠放整齐并在transfer buffer中浸透（保证中间无气泡）。
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