免疫荧光（IF）实验操作步骤及详细说明
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一、试剂和溶液
10X PBS：80g NaCl，2g KCl, 14.4g Na2HPO4 和 2.4g KH2PO4 加 1L 纯水，调 pH 至 7.4 洗涤液：1× PBS：纯水稀释 10X PBS；1× PBST：含 0.05% Tween-20 的 1×PBS 固定液：4%多聚甲醛：4g 多聚甲醛溶于 100ml PBS 通透液：0.1% triton-100 封闭液：PBS 配制的 3% BSA 抗体稀释液：一抗稀释液：3% BSA；二抗及鬼笔环肽稀释液：1X PBS；DAPI: 纯水稀释
二、实验步骤
1.细胞爬片：将盖玻片在酒精灯上灼烧片刻灭菌，铺在 12 孔板中，然后接种细胞，置于 37℃，5% CO2 培养箱过夜，待细胞形态完全伸展开并且处于健康状态，细胞密度为 40%-50%（做爬片的细胞一般 是复苏细胞传代 2 代后的细胞）； j biol chem2.洗涤：倒掉细胞培养液，1×PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；
3. 固定：4%多聚甲醛固定细胞，室温放置 20min,倒掉多聚甲醛，加入适量 PBS； 4.冻存：-20℃保存（如果直接使用，可跳至 7）；
傅科摆原理
5.解冻：常温下放置 30 min；
6. 洗涤： PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；
7. 通透：加入适当体积的通透液室温放置 10min。（若蛋白为膜表达则无需此步） 8.洗涤：PBS 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min；
微型核电池9.封闭：加入适当体积的封闭液，室温放置 30 min；
10. 一抗孵育：倒掉封闭液，加入适当体积及浓度的一抗，37℃孵育 60min；
11. 洗涤：PBST 轻微振荡洗涤 3 次,每次 5min；
12.二抗孵育：加入适当体积及稀释比的荧光二抗， 37℃避光孵育 50 min；（如果一抗是荧光素标记的 则无需此步）；
dc-hsdpa13.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤 3 次,每次 5min；
破碎机刀具14.核染：加入适当体积及稀释比的核染料 DAPI 室温反应 10min （如果无需加鬼笔环肽，可洗涤后跳至 16）；
15.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤 3 次,每次 5min；
16.细胞骨架染：此步骤只针对有细胞核定位的项目；加入反应体积为 0.2ml，适当稀释比的鬼笔环肽， 避光 37℃孵育 60 min 或 4℃孵育过夜；
17.洗涤：PBST 轻微振荡洗涤 2 次,每次 5min，纯水轻微振荡洗涤 5min；
18.封片：取干净的载玻片，分别标记和编号，在载玻片上滴加适量防荧光猝灭封片剂，用镊子取出盖玻 片，细胞面朝下，盖在载玻片上；
19.荧光显微镜观察，记录结果。
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