山东畜牧兽医2014年第35卷
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贾芳芳①燕海平②王琳琛①付军权①
（①北京勤邦生物技术有限公司 102206 ②河南省陕县畜牧局）
摘要本文利用胶体金免疫层析技术研制了一种快速检测牛奶中林可霉素的试纸条，经过测试，该试纸条的检测限
为20μg/L，检测时间为10min，假阳性率和假阴性率均为0，该方法准确，可靠，使用简便，适合大量样品的现场检测。
关键词 林可霉素胶体金免疫层析试纸条快速检测
中图分类号：S851.2+1 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2014)12-0004-03
林可霉素是生物合成的抗菌药物，对革兰氏阳性菌、部分厌氧菌和支原体有较强抗菌活性，尤其是对
该抗生素敏感的耐青霉素细菌所引起的感染有杀灭作用[1]。该药物常作为饲料添加剂，预防动物疾病[2-3]。因此，会造成药物在牛乳中残留，而牛奶中残留的抗生素会危害人的身体健康。农业部颁布的《动物性食品中兽药最高残留限量》(235号公告)规定了林可霉素在牛奶中的最大残留限量为150μg/kg[4]。牛奶等动物源食品中兽药残留越来越引起人们的关注。有调查研究表明，中国北方市场的约800份乳品采样中，抗生素残留超标严重[5]。牛奶生产中不规范用药和停药可能导致消费者一次性摄入高剂量药物残留。因此有必要对牛奶中的抗生素残留进行有效的检测和监控。
针对林可霉素的测定，GB 29685-2013《食品安全国家标准动物性食品中林可霉素、克林霉素和大观霉素多残留的测定气相谱—质谱法》[6]，农业部1163号公告-2-2009《动物性食品中林可霉素和大观霉素残留检测气相谱法》[7]均采用仪器方法，仪器方法灵敏度高，但是操作复杂，费用昂贵，需要专门的技术人员进行操作，不宜推广。因此，有必要建立一类准确、快速、简便的林可霉素检测方法，以此来保障人类健康，并维护正常的进出口贸易。在现有的快速检测方法中，发现胶体金免疫层析试纸条法具有灵敏度高、检测时间短、准确度高、易贮存、携带方便、可进行现场操作等特点[8]，是筛查牛奶中林可霉素残留量的重要手段。基于上述原因，本研究对林可霉素胶体金快速检测试纸条进行了探索和研制。
1 材料与方法
1.1 材料与仪器
林可霉素、各种交叉反应药物(纯度≥95%)等标准品购自北京标准物质研究中心，氯金酸(HAuCl4·3H2O)、卵清蛋白(OVA) 均购自美国Sigma公司，柠檬酸三钠、碳酸钾购自北京百欣试剂公司，分泌林可霉素单克隆抗体的杂交瘤细胞株为本单位制备保存；硝酸纤维素膜(NC 膜)、样品垫、吸水垫购自上海捷宁生物技术有限公司，Isoflow点膜仪、试纸条切刀购自美国Biodot公司，冷冻干燥机购自湖南湘立科学仪器有限公司，磁力搅拌加热器购自河南圣亚仪器仪表有限责任公司。复溶缓冲液：含牛血清白蛋白0.1%~0.3%(体积百分含量)、吐温-80 0.05%~0.2%(质量百分含量)、pH7.2的0.02mol/L磷酸盐缓冲液。
1.2 方法
粘滞阻尼系数1.2.1 林可霉素半抗原的制备将4-溴丁酸0.5g溶于20ml 甲醇中，加入1.0g甲醇钠，溶解后加入0.7g林可霉素，65℃反应20h，减压蒸干溶剂，乙醇-水重结晶，得白粉末状产物，得率58%。
1.2.2 林可霉素半抗原与卵清蛋白偶联物合成取12mg 半抗原，溶解于1ml DMF中，得到溶液A，取30mg EDC 和NHS用0.2ml水充分溶解后于加入溶液A中，室温下搅拌24 h，即可得到反应液B。称取OV A50mg，使之充分溶解在3.8ml PBS(pH7.2)中，将反应液B逐滴缓慢滴加到蛋白溶液中，并于室温下搅拌24h，用0.01mol/lPBS，4℃透析3d每天换3次透析液，以除去未反应的小分子物质。分装，于-20℃保存备用。
1.2.3 林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备 （1）胶体金的制备：用双蒸去离子水将1%氯金酸稀释成0.01%(质量百分含量)，取100ml置于锥形瓶中，用恒温电磁搅拌器加热至沸腾，在持续高温、持续搅拌下加入2.5ml 1%柠檬酸三钠，继续匀速搅拌加热至溶液呈透亮的红时停止，冷却至室温后用去离子水恢复到原体积，4℃保存。制备好的胶体金外观纯净、透亮、无沉淀和漂浮物。（2）林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物的制备：在磁力搅拌下，用0.2mol/L碳酸钾溶液调胶体金的pH至7.2，按每毫升胶体金溶液中加入50μg的标准向胶体金溶液中加入林可霉素单克隆抗体，搅拌混匀，室温静置10min，加入10%牛血清白蛋白(BSA)，使其在胶体金溶液中的终浓度为1%(体积百分含量)，静置10min。12000r/ min，4℃离心40min，弃上清液，沉淀用复溶缓冲液洗涤两次，用体积为初始胶体金体积1/10的复溶缓冲液将沉淀重悬，置4℃备用。htc a310
阻塞密度1.2.4 将林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物冻干到微孔试剂上 向微孔试剂微孔板中加入100μl林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物，放入冷冻干燥机中，在冷阱温度为-50℃条件下，预冻3h后，再真空干燥15h，即可取出，得
2014年第12期（总第215期) 试验研究 5
到冻干有林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物的微孔试剂，密封保存。
1.2.5 样品吸收垫的制备 将样品吸收垫置于含0.5%牛血清白蛋白(体积百分含量)、pH7.2、0.1mol/L 钢结构运输
磷酸盐缓冲液中浸泡2h ，37℃烘2h 备用。
1.2.6 反应膜的制备 用磷酸缓冲液将林可霉素半抗原-卵清蛋白偶联物稀释到10mg/ml
，用Isoflow 点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的检测区(T)，包被量为1.0μg/cm 2；用0.01mol/L 、pH7.4的磷酸盐缓冲液将羊抗鼠IgG 抗体稀释到200μg/ml ，用Isoflow 点膜仪将其包被于硝酸纤维素膜上的质控区(C)，包被量为1.0μg/cm 2。将包被好的反应膜置于37℃条件下干燥2h ，备用。
1.2.7 检测林可霉素试纸条的组装制备 （1）试纸：样品吸收垫1、反应膜2、吸水垫3和保护膜7依次
按顺序粘贴在所述底板6上，样品吸收垫的末端与反应膜的始端相连，反应膜的末端与吸水垫相连，样品吸收垫的始端与底板的始端对齐，吸水垫的末端与底板的末端对齐，试纸粘贴有保护膜，保护膜7覆盖在样品吸收垫上，为检测端，上面印有MAX 标记线，检测线4包被有林可霉素半抗原-载体蛋白偶联物，质控线5包被有羊抗鼠抗抗体(如图1)。（2）微孔试剂：微孔试剂8具有微孔塞9，微孔试剂中冻干有林可霉素单克隆抗体-胶体金标记物(如图2)。
图1 试纸条结构
图2 微孔试剂结构
1.2.8 检测方法 用微量移液器吸取200ml 待检样本于微孔中，缓慢抽吸且充分与微孔中试剂混匀。室温(20~25℃)孵育5min 后，将标记好的试纸条插入微孔中——印有“MAX”线端朝下，使之充分浸入溶液中。再次室温(20~25℃)孵育5min 后，取出试纸条并根据示意图判定结果，其他时间判定无效。当质控线(C)显示一条红条带，而检测线(T)不显，试纸以显示红线“|”，判为阳性。当质控线(C)显示一条红条带，检测线(T)同时也显示出一条红条带，试纸以显示红线“‖”，判为阴性。当质控线(C)不显示出红条带，则无论检测线(T)显示出红条带与否，该试纸均判为无效(如图3)。
1.2.9 样本检测限 在空白牛奶样本中分别添加林可霉素标准品至质量浓度为0、5、10、15、20、25、30μg/L ，按照1.2.9所述方法用三批试纸条进行检测，每个浓度重复5次，根据实验结果确定样本检测限。
图3 林可霉素胶体金试纸条结果判定示意图
1.2.10 试纸条的特异性 分别配制1000μg/L 的磺胺类、氯霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类、四环素类等药物，用此试纸条检测，重复3次，判断试纸条的特异性。 1.2.11 准确性 农业部文件要求胶体金免疫层析法的准确性以假阳性率和假阴性率表示[9]。取空白牛奶样品和添加林可霉素质量浓度为20μg/L 的阳性牛奶样品各50份，用试纸条进行检测，计算假阳性率和假阴性率。
1.2.12 试纸条的重复性 从3个批次中随机抽取试纸条，对空白牛奶和添加林可霉素质量浓度为20μg/L
的阳性牛奶样品进行3次重复测定，根据实验结果判定试纸条的重复性。
1.2.13 试纸条的稳定性 将足量的试纸条保存于2~8℃环境中，每隔1个月取出适量，分别检测空白牛奶样品、添加林可霉素质量浓度为20μg/L 的阳性牛奶样品各10份，重复测定2次，根据实验结果判定试纸条的稳定性。 2 结果与分析
2.1 样本检测限
用试纸条检测林可霉素浓度分别为0、5、10、15、20、25、30μg/L 的牛奶样品，按照1.2.9所述方法进行检测，确定检测限。以只出现C 线时的最低标准品质量浓度作为试纸条的检测限，由此得出，该试纸条检测限为20 μg/L ，见附表。
附表 林可霉素快速检测试纸条的检测限 (μg/L)
林可霉素浓度 0 5 10 15 20 25 30 检测结果 - - - - + + + 注：- 表示阴性，+ 表示阳性。
2.2 特异性
该试纸条检测1000μg/L 的磺胺类、氯霉素、氨基糖苷类、氟喹诺酮类和四环素类等药物，结果均呈阴性，即与其他药物无交叉反应，该试纸条特异性强。 2.3 准确性
试纸条检测的50份空白牛奶样品，均显示为阴性，假阳性率低于5%；添加林可霉素质量浓度为20μg/L 的50份阳性牛奶样品的检测结果均为阳性，试纸条假阴性率为0，符合要求。 2.4 重复性和稳定性
经验证，试纸条的批内和批间重复性为100%。试纸条在2~8℃下能够保存12个月；从第13个月起，试纸条出现失效现象。 3 结论
（1）林可霉素胶体金试纸条操作简便，无需设备，
山东畜牧兽医 2014年第35卷
李春莉 李芳玲 张天桥 （山东省齐河县畜牧兽医局 251100)
摘要 以蜂王浆的不同剂量做比较，研究其改善小鼠睡眠作用的效果，选择较合适的改善睡眠的剂量。进行各剂量对钠睡眠时间的延长作用及睡眠潜伏期试验。结果表明，中剂量小鼠睡眠时间显著延长，睡眠潜伏期明显缩短，说明王浆有明显改善小鼠睡眠的作用。
关键词 蜂王浆 改善睡眠 钠
中图分类号：S896.3 文献标识码：A 文章编号：1007-1733(2014)12-0006-02
蜂王浆是由5-15日龄的工蜂上颚腺所分泌的乳白或淡黄乳状液体。鲜王浆中水分占62.5%~70.0%，干物质占30.0%~37.5%。干物质中蛋白占36.0%~55.0%，氨基酸约占王浆干重的0.8%，包含10-羟基癸烯酸等在内的脂类物质占7.5%~15%。此外，蜂王浆中还含有磷脂质以及丰富的维生素，其中以B 族维生素最丰富[1-3]。蜂王浆有改善睡眠的作用，不但可提高入眠速度，还能提高睡眠质量，无任何毒副作用。本文就其改善睡眠的作用进行了研究及探讨。 1 材料与方法 1.1 材料
钠(进口瓶装)、昆明种小白鼠(福建吴氏实验动物研究中心提供)生产许可证号：SCXK(闽)2004-0002、AE200S 型电子分析天平(Mettler-Toledo Instr. Ltd shang hai)、一次性无菌注射器(1ml ，江西洪达医疗器械集团有限公司生产)。蜂王浆溶液：取蜂王浆(福建神蜂科技开发有限公司提供)4.165、6.250、8.333、10.417g 溶于20ml 蒸馏水配制成0.208、0.313、0.417、0.521g/ml 的溶液分别用于2组、3组、4组、5组的实验动物。 1.2 方法
1.2.1 分组 正常成年人每次服用3g 左右的蜂王浆就可以产生睡眠作用[4]，即3g/60kg 。按此50倍[5]的剂量将雄性小白鼠(每只约25g)随机分为5组，即对照组(1组)、2g/60kg(2组)、3g/60kg(3组)、4g/60
kg(4组)、5g/60kg(5组)，每组10只，以此出蜂王浆改善睡眠的低、中、高 3个剂量。动物试验前均在实验室适应性喂养3d ，然后在自然光照，自由饮食和自由进水的条件下，喂养28d 。第30天起，每天早上8:00-10:00灌喂不同浓度的王浆0.2ml 。 1.2.2 钠用量 为了确定100%的小白鼠进入睡眠的钠的最小剂量和其阈下睡眠剂量，即80%~90%的小白鼠翻正反射不消失的钠最大阈下睡眠剂量。小白鼠随机分为6组，每组10只，各组动物腹腔注射钠不同剂量，记录30min 内入睡的动物数[6]。
封包过滤器操作时间短，一般仅需10min ，能够达到定性检测水平。由于试纸条方便、快捷、成本较低，非常适用于在我国基层检测实验室、政府部门的市场监控检测、临时抽检、排查工作中广泛推广使用，并且能够解决基层单位因设备和经费问题而较难开展食品中残留物检测和监控等工作的问题，为农业质检、卫生部、工商管理、养殖业等机构的食品安全检测提供检测技术及产品，利于食品安全监控计划的执行[10]。（2）评价胶体金试纸条质量的一个重要方面是稳定性，本研究通过分析该试纸条批内、批间差异以及在2~8℃温度下的保存时间，验证了该试纸条具有良好的稳定性。（3）本研究将胶体金标记的单克隆抗体直接冻干在微孔试剂中，这样能够使金标抗体与待检样品液充分接触，充分反应，增加灵敏度。然而，胶体金免疫层析法主要通过目测颜来判断结果，较为主观，可能出现假阳性问题，因此对于阳性样本，还需要利用仪器方法进行确证。
参考文献
图像拼接器
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（收稿日期：2014–07–11）
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