实验目的 | 1、学习从自然界中分离蛋白酶产生菌并纯化; | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
实验原理 | 许多细菌和霉菌产生蛋白酶,细菌中的芽孢杆菌是常见的蛋白酶产生菌。本实验将土壤样品(或其他样品)悬液加热处理,杀死非芽孢细菌及其他微生物后进行划线分离得到芽孢杆菌,将其接种到酪蛋白平板进行培养,根据酪蛋白平板的水解圈作初筛。也可直接将细菌或霉菌接种到酪蛋白平板进行培养,分离筛选其他蛋白酶产生菌。 基因突变可分为自发突变和诱发突变。许多物理因素、化学因素和生物因素对微生物都有诱变作用,这些能使突变率提高到自发突变水平以上的因素称为诱变剂。 紫外线(UV)是一种最常用的物理诱变因素。它的主要作用是使DNA双链之间或同一条链上两个相邻的胸腺嘧啶间形成二聚体,阻碍双链的分开、复制和碱基的正常配对,从而引起突变。紫外线照射引起的DNA损伤,可由光复活酶的作用进行修复,使胸腺嘧啶二聚体解开恢复原状。因此,为了避免光复活,用紫外线照射处理以及处理后的操作应在红光下进行,并且照射处理后的微生物放在暗处培养。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
试剂 | 距离地面十公分的土壤、酪素培养基 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
实验器材 | 恒温培养箱、恒温水浴锅、酒精灯、培养皿×8、试管×11、玻璃棒、移液管、量筒、三角瓶、烧杯、滴管、涂布器、血细胞计数板、移液、显微镜、紫外线等(15W)、磁力搅拌器、台式离心机、震荡混合器等 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
实验方法与步骤 | 1、酪素培养基的配置:牛肉膏3g、NaCl 5g,酪素 10g,琼脂 20g,水1000mL, pH 7.6-8.0。配制方法:称取酪素4g,先用少量2%NaOH润湿,玻璃棒搅动,再加适量的蒸馏水,在沸水浴中加热并搅拌,至完全溶解,补足水量至1000mL,加入其他成分,调整pH值,灭菌备用。 2、菌悬液的制备 取土壤20g,加水200ml,即梯度为10ˉ1的菌悬液,取1ml10ˉ1的菌悬液,加9ml的蒸馏水,即梯度为10ˉ2的菌悬液,按上述的方法步骤制作梯度为10ˉ3、10ˉ4、10ˉ樱桃采摘机5的菌悬液。将制作好的菌悬液做好标记,至温度为80℃的水浴锅热处理30min。 3、接种与培养:在超净台将上述经过热处理菌悬液按下表接种
用涂布器涂均匀。放在温度为32℃恒温培养箱倒置培养48h。 4、菌种的选育:菌悬液的制备① 取培养48小时生长旺盛的出发菌株斜面1支,取2环接入10 ml 无菌生理盐水菌中,倒入盛有玻璃珠的小三角烧瓶中,振荡30分钟,以打碎菌块。② 将上述菌液离心(3000 r/min,离心15分钟),弃去上清液,将菌体用无菌生理盐水洗涤2-3次,最后制成菌悬液。③ 用显微镜直接计数法计数,调整细胞浓度为每毫升108个。平板制作:将淀粉琼脂培养基溶化后,冷至铁水预处理55℃左右时倒平板27套,凝固后待用。紫外线处理:① 将紫外线灯开关打开,预热约20分钟。② 取直径6cm无菌平皿2套,分别加入上述调整好细胞浓度的菌悬液3ml,并放入一根无菌搅拌棒于平皿中。③ 将上述2套平皿先后置于磁力搅拌器上,打开皿盖,在距离为30cm,功率为15W的紫外线灯下分别搅拌照射1分钟和3分钟。盖上皿盖,关闭紫外灯。稀释:在红灯下,将上述经诱变处理的菌悬液以10倍稀释法稀释成10-1-10-6(具体可按估计的存活率进行稀释)。涂平板:取10-4、10-5、10-6三个稀释度涂平板,每个稀释度涂平板3只,每只平板加稀释菌液0.1ml,用无菌玻璃刮棒涂匀。以同样操作,取未经紫外线处理的菌稀释液涂平板作对照。培养:将上述涂匀的平板,用报纸包好,置37℃培养48小时。注意每个平皿背面要标明处理时间和稀释度。计数:将培养48小时后的平板取出进行细菌计数,根据对照平板上菌落数,计算出每毫升菌液中的活菌数。同样计算出紫外线处理1分钟、3分钟后的存活细胞数及其致死率。 % ×100% 观察诱变效应:将细胞计数后的平板,分别向菌落数在5-6个左右的平板内加碘液数滴,在菌落周围将出现透明圈。分别测量透明圈直径与菌落直径并计算其比值(HC值)。与对照平板进行比较,根据结果,说明诱变效应。并选取HC比值大的菌落移接到试管斜面上培养。此斜面可作复筛用。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
数据处理 | 产酶微生物的分离与纯化结果:五种梯度的培养基都长有菌种,其中以10ˉ5梯度的培养基中菌种长势最佳,菌种成白,大多为单菌落,并且在单菌落外形成了透明的水解圈。 紫外诱变结果 表2 紫外线诱变结果
诱变效应记录表 表3 诱变效应记录表
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实验结论 | 土壤中存在大量的产酶的芽孢杆菌,经酪素培养基培养后能形成透明的水解圈;紫外线对微生物能产生诱变效应,紫外线照射的时间不同产生的诱变效应不同。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
误差分析 | 影响紫外线诱变效应的原因主要有:一、培养基的PH不适合产酶芽孢杆菌的生长和繁殖,倒置诱变的细胞补足;二、在做菌悬液稀释时没有标准稀释,浓度还是太高,经培养后菌落太密集,紫外线诱变结果计数不准确;三、在紫外线照射时,稀释液离紫外灯补足30cm或超过30cm,或培养皿盖没有打开,或时间不足或时间超过,这些都会引起紫外诱变效果。 | ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||||
本文发布于:2024-09-22 02:11:07,感谢您对本站的认可!
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