动物蛋白酶解研究（）
北京工商大学 宋焕禄
天调食品配料有限公司 廖国洪
摘要
本文主要目的是以美拉德（Maillard）反应产物（MRPs）的风味为判断依据，以水解度(DH)为动物蛋白酶解液——Maillard反应底物之一的特征性指标，根据MRPs的风味确定动物蛋白水解液的最佳DH或DH范围。实验的主要内容包括： 1. 以牛肉为酶解底物，对所用的几种蛋白酶进行酶活测定
2. 确定各酶的适宜加量和反应时间
3. 确定最佳酶组合及其最佳反应条件
4. 用最佳反应条件下制得的动物蛋白水解液进行Maillard反应，感官评定产物风味。
关键词 动物蛋白水解液 水解度（DH） 酶解 Maillard反应
1．概述
1.1 肉味香精研究进展
肉味香精研究及生产中有关肉味形成机理的报道很多。随着肉味香精的需求量日益增加，有关肉味香精的研究也不断深入和扩展。肉味香精中各种香味物质的形成主要是通过Maillard反应产生。参与反应的底物中氨基酸或多肽对风味物质的形成有重要影响。根据已有的研究结果，通常认为，Maillard反应产物中含硫化合物、杂环化合物和羰基化合物对肉味形成有重要影响[1]。这些风味物质的形成机理极其复杂。杂环化合物中以吡咯类、吡嗪类、噻吩类等化合物贡献较大[2]。对Maillard反应产物的一系列研究表明，它还具有抗氧化、抗诱变等多种性能[3]。此外，人们还从蛋白质结构及肽键顺序等方面对Maillard反应产物进行分析，以期到它们与产物风味之间的某种关系[4]。 酶解法是一种新兴的动物蛋白水解液的生产方法。与已有的生产方法相比，酶解法有很多优点，因此对酶法生产动物蛋白水解液的研究很受重视。人们从酶解机理、酶解原料、酶
及酶解液等多方面进行了大量深入研究。G.M.O′Meara和P.A.Munro以米氏方程和兰格缪尔等温吸附模型为基础，研究了瘦肉的酶解动力[5]，并对酶解反应的影响因素如pH值、温度、时间、酶/底物比及底物浓度分别进行研究[6]。研究者还试图从不同途径寻更有效的酶，研究酶的性质、结构、作用特点、反应条件以及单、多酶水解效果的比较、不同底物水解效果的比较,等等[7]。
人们还注意到，由于水解条件的变化，得到的水解液有时会含有苦味，并影响到后面的Maillard反应产物的风味。研究认为，其原因是某种蛋白质含有疏水性氨基酸，它们常隐藏在蛋白质内部中，一旦水解暴露出来就会显出苦味[8,9]。生产动物蛋白水解液的原料由于价格问题，生产成本一直降不下来。近年来人们一直在寻价廉易得的生产原料，已用于生产的有植物蛋白替代品、肉类生产副产物（骨头残肉、动物毛血等），但存在很多问题和欠缺，有待解决。
1． 2 蛋白质水解液的生产方法
1.2.1酸/碱法：
酸/碱水解法较早用于生产,工艺条件比较成熟。该法主要是用浓酸或浓碱在加热条件下降解蛋白质,得到的水解液经过中和后即可用于生产。酸水解法的优点是水解很彻底,目前该产品广泛用做为调味品的原料，缺点是某些氨基酸被破坏，且需控制水解液中的氯丙醇含量[10,11]。碱法水解不被推荐，因为不仅水解液味道很较，且其中氨基酸会发生消旋化。
1.2.2 酶水解法
用蛋白酶在其适宜的作用条件下水解蛋白质,得到的水解液经过灭酶后就可以用于生产。酶解法的优点是作用条件温和,产物安全无毒,而且基础风味纯净。但是酶法生产的水解液水解度不高,这会影响到后来的Maillard反应产物的风味。酶解法目前应用非常广泛,并且越来越受到重视。
1.2 酶解法
1.酶解机理[8]
一般认为,蛋白质酶解时肽键水解断裂的过程如下:
a.肽键断开
-CHR-CO-NH-CHR离子电推进′- + H2O E -CHR-COOH + NH2-CHR′-
b.质子交换
-CHR-COOH + NH2-CHR′- -CHR-COO- + NH3+-CHR′-
c.氨基滴定
NH3+-CHR′- + OH- NH2-CHR′- + H2O
2.影响因素
蛋白质酶解的影响因素包括温度、pH值、时间、酶量、底物浓度等。不同的酶对应有不同的最适pH值、最适温度及反应时间等条件要求。对同一种酶来说，底物不同则反应条件也不尽相同，由此得到的产物也各不相同。
3.常用的蛋白酶类
酶法生产蛋白质水解液常用的几种酶及其特性如下表所示:
表1. 几种蛋白酶的特性
相关项 酶类 | 作用特性 最适pH值QDFILM 最适温度(℃) 标注活力 |
Flavorzyme Alcalase Protamex Neutrase 中性蛋白酶 | 内+外肽酶 5.0-7.0 50 1000LAPU/g 内肽酶 6.5-8.5 55-75 2.4AU/g 复合内肽酶 5.5-7.5 55-60 1.5AU/g 内肽酶 5.5-7.0 50-60 0.5AU/g 内肽酶 5.5-7.0 37-50 5-20万U/g |
| |
注：
1U——40℃、pH3.0时1min内水解酪蛋白产生1μg酪氨酸的酶量。
1AU——25℃下1min内水解变性血红蛋白产生1mmol酪氨酸的酶量。
1LAPU——25℃下1min内水解1mmol的L-leu-对硝基苯胺的酶量。
2．实验材料与方法
2.1 实验材料
2.1.1 原料
市售新鲜鸡胸肉，绞碎后冷藏备用。
2.1.2 试剂
磷酸盐（标准物质）缓冲液 pH6.864
硼砂（标准物质）缓冲液 pH9.182 上海市爱建现成试剂厂
邻苯二甲酸氢钾缓冲液 pH4.003
氢氧化钠 分析纯 北京化工厂
硫酸铜 分析纯vga连接器 新乡市第八化工厂
硫酸钾 分析纯 北京化工厂
硼酸 分析纯 哈尔滨市化工试剂厂
盐酸 化学纯 北京化工厂
浓硫酸 分析纯 北京化工厂
1%酚酞乙醇指示剂（1g酚酞溶于100ml乙醇中）
无水乙醇 化学纯 北京化工厂
无水碳酸钠 分析纯 北京化工厂
邻苯二甲酸氢钾 分析纯 北京化工厂
磷酸氢二钠 分析纯 北京红星化工厂
磷酸二氢钠 分析纯 北京红星化工厂
三 分析纯
福林试剂 实验室自备（1份试剂与1.5份水混合）
干酪素 化学纯 上海化学试剂供应站
L-酪氨酸 BR 公私合营上海生物化学制药厂
甲醛 优级纯 北京市旭东化工厂
Flavorzyme Novo Nodisk 公司提供
Alcalase Novo Nodisk 公司提供
Protamex Novo Nodisk 公司提供
Neutrase Novo Nodisk 公司提供
中性蛋白酶 无锡酶制剂厂
植物蛋白水解液 自制
L-半胱氨酸盐酸盐
木糖
氯化钠
2.1.3 设备
电子万用炉 1000W 天津市中环实验电炉有限公司
改良式微量凯氏定氮蒸馏装置
光学读数分析天平 TG328B 上海第二天平仪器厂
架盘药物天平 HC-TP11B•5 北京医用天平厂
上皿电子天平 JA2003 上海天平仪器厂
精密酸度计 PHS-2C型 上海雷磁仪器厂
电热恒温水浴锅 HH-S112型 江苏省医疗器械厂
磁力加热搅拌器 HJ-1型 江苏省国华仪器厂
分光光度计 721型程控电压衰减器 上海第三分析仪器厂
离心沉淀器 800型 上海手术器械厂
阿贝折光仪
高压灭菌锅 山东新华医疗器械厂
2.2 实验方法
2.2.1 样品蛋白质含量的测定：微量凯氏定氮法
2.2.2 酶活测定：福林法
2.2.3 固形物含量测定：折光法测定。
2.2.4 氨态氮测定：甲醛电位滴定法。
2.2.5 水解度（DH）的测定
水解度的定义是水解肽键数占肽键总数的百分比。测定水解度（DH） 采用甲醛法（同氨态氮测定）。计算如下；
n-NH2= ×1
式中
V-V0 氢氧化钠标准溶液滴定耗用量（ml）
C 氢氧化钠标准溶液浓度（mol/L）
苯胺的制备W 水解用样品克数（g）
Vtot 水解液总体积(ml)
V 水解液取用体积(ml)
htot=(1×Pro%)/110
式中
htot 原料蛋白质中所含肽键总数（mmol/g原料）
Pro% 样品的蛋白质含量
110 氨基酸平均分子量
则有
DH%=(n-n0)×100/htot
3. 研究內容与结果讨论
3．1样品蛋白质的测定：经凯氏定氮法测定，样品的蛋白质含量为20.07% 。
3．2 酶活测定
表2. 几种蛋白酶的酶活
酶名 相关项 | Flavorzyme Alcalase Protamex Neutrase 中性酶 |
最佳pH值 | 7.0 7.5 6.5 6.5 7.5 |
最适温度(℃) | 50 55 55 55 37 |
称酶量(g) | 0.1026 0.1053 0.0934 0.0882 0.0959 |
稀释倍数 | 200 3000 250 100 500 |
吸光度A1 | 0.190 0.208 0.340 0.193 0.347 |
吸光度A2 | 0.191 0.200 0.339 0.187 0.344 |
吸光度A3 | 0.190 0.205 0.339 0.190 0.349 |
吸光度A | 0.190 0.204 0.339 0.190 0.347 |
酶活（U/g） | 14470 227062 35450 8416 70681 |
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一水氢氧化锂
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