四川大学学报（医学版）2021, 52 (1 ) :76 - 81
J Sichuan Univ ( Med Sci) doi: 10.12182/20210160505
•论著•变异链球菌CRISPR-Cas9系统《/i2基因突变株的转录组学分析> 何晓雅，张安琪，龚涛，李雨庆&
口腔疾病研究国家重点实验室国家口腔疾病临床医学研究中心四川大学华西口腔医院（成都610041)
【摘要】目的对变异链球菌CRISPR-Cas9系统c s m2基因突变株的转录组基因表达差异进行分析。方法培养变异链球菌UA159、基因的缺失菌株Acs«2及回补菌株。提取总RNA，采用高通量测序技术，进行转录组测序，基于差异表 达基因GO和KEGG数据库分析的基础上，对其参与的生物学过程进行挖掘，采用qRT-PCR的方法验证转录组测序结果。 结果转录组结果显示与UA159相比，Acs«2中基因表达量变化在1倍以上的基因有176个(P<0.05)，其中上调表达基因 72个，下调表达基因104个，通过GO功能富集分析及KEGG代谢通路富集分析，发现上调和下调的差异表达基因(DEG)均 参与的功能为氨基酸转运和代谢。除此之外，上调的DEG参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、能量产生和转化、转 录等有关；下调的DEG主要与脂质代谢、DNA的复制、重组和修复、信号转导机制、核苷酸转运和代谢等生物过程有关，还有部分DEG的功能尚不清楚。qRT- PCR验证发现，与UA159及Acs«2/pDL278-csM2菌株相比，与支链氨基酸形成相关的 基因/^A、/ewC和/ewD在Zks/i2中的表达显著下调。结论通过转录组测序和qRT-PCR验证发现中与支链氨基酸合成与细胞膜通透性相关的基因表达量发生了明显变化。
【关键词】变异链球菌CRISPR-Cas csn2转录组
Transcriptomic Analysis of c s n l Gene Mutant Strains of S trep to co c c u s m u ta n s CRISPR-Cas9 System H E X ia o-y a y Z H A N G An-qiy G O N G T aoy LI Y u-qin g^. S ta te K e y L a b o ra to ry o f O ral D iseases, N a tio n a l C linical Research C en ter f o r O ral
D iseases, W est C hina H o sp ita l o f S tom atology, Sichuan U n iversity, Chengdu 610041, China
牵引头A Correspondingauthor,E-mail:****************
【Abstract 】Objective To explore the differences in transcriptional levels between mutant strains of c s n l gene of CRISPR-Cas9 system of Streptococcus m u ta n s (S. m u ta n s) and wild-type strains. Methods The S. m u ta n s UA159, c s n l-gene-deleted strains (Acs«2) and cs«2-gene-covering strains (Acsw2/pDL278-cs«2) of S. m u ta n s were cultivated. Total RNA was extracted, and high-throughput sequencing technology was used for transcriptome sequencing. Based on the
GO analysis and the KEGG analysis of the differentially expressed genes, the biological processes involved were thoroughly examined. The qRT-PCR method was used to verify the transcriptome sequencing results. Results The transcriptome results showed that, compared with UA159> there were 176 genes in Acs«2 whose gene expression changed more than one fold (P<0.05), of which 72 were up-regulated and 104 were down-regulated. The GO enrichment analysis and the KEGG enrichment analysis revealed that both the up-regulated and down-regulated differentially expressed genes (DEG) were involved in amino acid transport and metabolism. In addition, the biological processes that up-regulated DEGs participated in were mainly related to carbohydrate metabolism, energy production and conversion, and transcription; down-regulated DEGs were mainly related to lipid metabolism, DNA replication, recombination and repair, signal transduction mechanisms, nucleotide transport and metabolism. The functions of some DEGs were still unclear.
Results of qRT-PCR verified that the expressions of leu A y leu C and leuD (genes related to the formation of branched-chain amino acids) were significantly down-regulated in Acsn2when compared with UA159 and Acs«2/pDL278-cs«2.
Conclusion Through transcriptome sequencing and qRT-PCR verification, it was found that the expression of genes related to branched-chain amino acid synthesis and cell membrane permeabilit
y in Acs«2 changed significantly.
【Keywords】Streptococcus m u ta n s CRISPR-Cas csn2Transcriptome
龋病是人类常见的口腔疾病之一，其发病率高、分布 广，已被世界卫生组织(W H O)列为人类三大重点防治疾 病之一。变异链球菌(S(r e p M〇)£：c w s m w t f l/is)作为主要致 龋微生物之一，其致龋毒力包括产酸和耐酸性、产生细胞 外多糖和对牙面的黏附作用等，在龋病的发生发展中起 * *国家自然科学基金(No. 31870065)资助
A 通信作者，E-mail:**************** 着至关重要的作用。
Clustered regularly interspaced short palindrom ic repeats-CRISPR associated proteins(简称CRISPR-Cas系统)，是细菌为应对病毒或质粒不断攻击演化而来的获得 性免疫防御系统。研究发现，大约40%的细菌和90%的古 细菌拥有CRISPR-Cas系统，其结构主要由CRISPR array 和cas genes两大部分组成CRISPR-Cas 系统抵抗外源
第1期何晓雅等：变异链球菌C R I S P R-Cas9系统基因突变株的转录组学分析77
空气太阳能
遗传物质人侵主要分为3个阶段：适应、表达和干扰，即以 小片段R N A为向导，通过碱基互补配对对人侵的外源遗 传物质进行靶向定位，最终C a s酶对外源核酸进行剪切和降解151。
近期研究发现，某些口腔致病菌也含有C R I S P R-C a s系统，如变异链球菌|6'牙龈卟啉单胞菌181以及粪肠 球菌1研究表明，变异链球菌U A159菌株(S.w_n s
U A159)含有两种C R I S P R-C a s系统：C R I S P R l(t y p e I I-A)和C R I S P R2(t y p e I -C)1111。除了抵抗外源遗传物质人侵 之外，C R I S P R-C a s系统还参与该细菌其它生理活动的调 节，包括生物膜的形成、D N A修复、环境应激（P H、温 度、氧化应激)等|121。前期研究发现基因缺失会影响
变异链球菌胞外多糖合成以及酸耐受能力|131，我们推测 这些结果与基因缺失引发复杂的网络调控相关。因 此，本研究拟通过转录组测序（R N A-s e q u e n c e,R N A-s e q)与实时突光定量P C R(q u a n t i t a t i v e r e a l-t i m e P C R，q R T-P C R)对基因突变株A««2与U A159菌株中差异表达 的基因进行分析，并初步探讨对变异链球菌耐酸能
力的影响机制。
1材料和方法
1.1菌株及培养条件
S.U A159和S.m u f a n s A c s m2(本实验室构建）采用牛脑心浸液（b r a i n h e a r t i n f u s i o n,B
H I)培养基(O X O I D，美国）培养。cs«2基因回补菌株(A c s n2/p D L278- ««2)采用壮观霉素（1 000 |i g/m L)选择性B H I培养基培 养。菌株的生长条件均为37 过夜静置厌氧培养(体积
分数 10%C O2、10%H2、80%N2)。
1.2 R N A-s e q与数据分析
将U A159及A«n2的过夜培养物在B H I中1 :10稀释，生长至光密度(〇〇)«〇=0.5再取20 m L菌液冻存于液氮15 m i n，送样至上海美吉生物医药科技有限公司。本实验R N A-S e q 检测及原始数据质控均委托上海美吉生物医药科技有限 公司完成，R N A建库、富集，采用I l l u m i n a H i s e q4000测序 平台行2x150 b p测序。参考G e n e O n t o l o g y(G O)数据库 及K y o t o E n c y c l o p e d i a o f G e n e s a n d G e n o m e s(K E G G)数据 库对测序所得同源基因转录本进行功能注释和富集分析。
1.3耐酸性相关基因的q R T-P C R验证
本课题组前期研究发现《«2基因的缺失影响变异链 球菌耐酸能力|131，为了探索Cs n2缺失菌株耐酸系统对酸胁 迫的响应以及验证R N A测序结果的可靠性，选取A c«i2/ p D L278-«n2菌株与U A159及A c s n2变异株进行q R T-P C R检测。将U A159及A«n2、A c s n2/p D L278-c s n2菌株的过夜培养物在B H I中1 : 10稀释，生长至O D^O.5后，离心 收菌，提取细菌总R N A。然后使用P r i m e S c r i p t T M R T
r e a g e n t K i t w i t h g D N A E r a s e r试剂盒将R N A逆转录为
c D N A。选用16S r R N A U4丨作为内参弓j物，q R T-P C R检测支 链氛基酸(b r a n c h e d-c h a i n a m i n o a c i d,B C A A)形成相关的 基因Z e u C和f e w D，见表 1〇根据T B G r e e n*P r e m i'x£x
T a g™II(Tli R N a s e H P l u s)说明书加样，各基因引物设置 不含c D N A的阴性对照d通过L i g h t C y c l e r48〇H S y s t e m程 序上机扩增，获得目的基因及内参基因的C t(c y c l e
t h r e s h o l d)值。采用法对目的基因的相对表达水平
进行计算分析，得到各目的基因差异表达情况。
表1qPCR反应所用引物
Table 1Prim ers used in qPCR
Primer Sequence (5’-3’）
16S rRNA-F AGCGTTGTCCGGATTTATTG
16S rRNA-R CTACGCATTTCACCGCTACA
leuA-F TTTCTTGACACAACGCTCCG
leuA-R ACGAGCCAGACCTGATACAG
leuC-F AGATGCTGGCTTTGAATGGC
leuC-R GCCTCCGGTAATTGACGAAC
leuD-F ACCGACAGATGAAGTAACCGT
leuD-R GCTTGGACGGTTTTGCTCAT
1.4统计学方法
所有实验均重复3次。各组实验数据用L e v e n e’ste s t 对样本进行方差齐性检验，若样本方差齐，则进行两独立 样本t检验或单因素方差分析，若样本方差不齐，则进行 K r u s k a l-wallis非参数检验,P<0.05为差异有统计学意义。2结果
2.1差异表达基因的筛选
对U A159和A c s n2之间的差异表达基因（differentially e x p r e s s e d g e n e s,D E G s)进行分析，
构建火山图（图1)。如 火山图所示，以|log2(差异倍数)|>1且P矣0.05为筛选条件 时，U A159和A csm2之间共鉴定出176种D E G s。其中与 U A159相比，A o:«2菌株中72种D E G s趋于上调，104种
D E G s趋于下调。
2.2差异表达基因的G O及K E G G富集分析
如图2 ~图4所示，通过对上调的D E G s和下调的
D E G s进行G O功能富集分析及K E G G代谢通路富集分析，我们发现上调的D E G s参与的生物过程主要与碳水化合物代谢、氨基酸转运和代谢、能量产生和转化、转录等有 关；下调的D E G s同样参与氨基酸转运和代谢，除此以外
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四川大学学报(医学版)
第52卷
U pregulated
genes D ow nregulated
genes
■ Translation, ribosonmal structure and biogenessis ■ Cell division and chromosome portioning □ Stable RNA genes
■ Nucleotide transport and metabolism ■ Coenzyme metabolism ■ Cell secretion
■ Inorganic ion transport and metabolism ■ Signal transduction mechanisms
DNA replication, recombination and repair ■ Transcription ^ Lipid metabolism
Energy production and conversion ■ General function prediction only
■ Carbohydrate and m etabolism
■ Amino acid transport and metabolism
No database homology or function unknown
图2差异表达基因的分类和占比
Fig 2 Classification and percentage of the DEGs
Gene ontology enrichm ent analysis of the differentially regulated genes (P <0.05)托玛琳水杯
G 0:0009098|leucine biosynthetic process G 0:0006526|arginine biosynthetic process
G 0:0009081|branched-chain am ino acid metabolic process
GO:0006310|DNA recom bination
G 0:0006313|transposition, D N A -m ediated G 0:0071702|organic substance transport
GO:0051179|localization
G 0:0005275|am ino acid transport G 0:0008643|carbohydrate transport
GO-.00427421defense response to bacterium
■ U pregulated genes
■ D ow nregulated genes
10.80
10.46
10.67
10.41
■ 0.86
10.62
■ 0.750
0.2
0.4 0.6E nrichm ent ratio
0.8
1.0
3讨论
变异链球菌首先将碳水化合物摄入细胞中，经过一
系列代谢途径，从而发挥产酸、黏附、生物膜形成等与致 觸相关的生物学特性。研究表明变异链球菌主要通过磷 酸酶转移系统（p h o s p h o t r a n s f e r a s e s y s t e m ，P T S )完成对碳 水化合物的转运[151。转录组学分析揭示了c
m
2基因突变 株编码碳水化合物摄取系统中表达变化的基因。在图3差异表达基因的GO 富集分析
Fig 3 GO enrichm ent analysis of DEGs
A c s n 2中，编码P T S 酶I I (E IT )复合物的基因表现出上调趋
势。如：编码P T S 系统葡萄糖特异性转运子亚单位E I I A B C 白勺p f s G 上调了2.3倍；甘露醇特异性的P T S 操纵子(m f /A l
)
和Z e v 操纵子（S M U
_1956c -1961c )的表达也受到高度
诱导。
A B C
(A T P -b i n d i n g cassette , A
B C
)转运蛋白可以利用
三隣酸腺苷(a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t e , A T P
)水解的能量转
运各种生物分子，在变异链球菌中参与包括营养摄取、细
400
300C e 5
公交车线路牌Q U h 〇 200 W D
T
100
.U p-regulated DEGs »D ow n-regulated DEGs ，U nchanged genes
-15
-10
-5
log2 Fold change
图1变异链球菌UA159和菌株差异表达基因的火山图
Fig 1 V o lc a n o p lo ts o f D E G s in is o la te s U A 159 a n d \c s n l o f
Streptococcus m utans
还参与脂质代谢、D N A
的复制、重组和修复、信号转导
机制、核苷酸转运和代谢等生物过程。2.3 «/|2基因缺失菌株的耐酸性相关基因q
R T -P C R
分析
由转录组数据分析可知，
缺失菌株中与氨基酸
开关柜测温装置的合成代谢相关的基因存在明显表达差异，为了探索
c m
2缺失菌株耐酸系统对酸胁迫的响应以及验证R
N A
测
序结果的可靠性，选取差异表达基因中与支链氨基酸形
成相关的基因Z e u A 、Ze «C 和Z e w D 进行q R T -P C R
检测。如
图5所示，与U
A
159及A «n 2/p D L 278-csn 2 菌株相比 J e w A 、
Z e w C 和丨e w D
在A c s n 2中的表达显著下调(P <0.05), U
A
159与
△«n 2/p D L 278-c s n 2菌株中Z e w A 、/e w C 和丨的表达差异 无统计学意义。
S 3U 3
00JO
J 3q u m
z
第1期何晓雅等：变异链球菌C R I S P R-Cas9系统a s W基因突变株的转录组学分析79
KEGG enrichm ent analysis o f the differentially regulated genes (P<0.05)
Arginine biosynthesis C5-Branched dibasic acid metabolism Valine, leucine and isoleucine biosynthesis
Phenazine biosynthesis Biofilm form ation-Pseudom onas aeruginosa
Galactose metabolism
Tyrosine metabolism Phosphotransferase system (PTS)
Butanoate metabolism
ABC transporters
l0.27
10.16
0s—
0-15
0.2
10.48
11.00
11.00
10.40
10.16
10.36
I Upregulated genes ■ Down r egulated genes
0.4 0.6
Enrichm ent ratio
0.8
图4差异表达基因的KEGG富集分析 Fig 4 KEGG enrichm ent analysis of DEGs
i*S.m utans UA159
^S.m utans Acs«2
S.m utans Acs«2/pDL278-csn2
leuA leuC leuD黄粉虫筛选机
图5变异链球菌UA159、A cs/i2和Acsii2/pDL278-csji2耐酸性相关基因的qRT-PCR 结果
Fig 5 qRT-PCR assays for expression of genes related to acid tolerance ability
*P<0.05, vs. S. mutans UA159 and S. mutans Acsn2/pDL278-csn2.
菌素分泌、抗原呈递、免疫调节等在内的多种生物学过 程。其中M a l X、M a l F和M a l G是负责麦芽糖摄取的A B C 转运蛋白，c m2缺失菌株中其编码基因表达量显示出2.1倍的增加|161。
变异链球菌的多糖代谢(m u l t i p l e s u g a r m e t a b o l i s m, m s m)位点构成了一个非P T S糖摄取系统，负责棉子糖、蜜=糖和异麦芽三糖的转运和利用。转录组学分析显示 编码m s m簇的8个基因a客f l L、m s w£、m s m G、w w m/C、m s w R、於/A和d e x B表达上调。除此以外，其他与 糖代谢相关的基因包括S M(7_636、ci'f B、S A1C；_870和 g a/K同样上调:，与糖原生物合成有关的基因g/g P和
被高度诱导。而与胞外多糖合成密切相关的基因 如济/B、济/C、攻/D、g b p B和/f/以及调控乳酸生成过程的主 要基因W/i的表达水平基本保持不变。
与U A159相比，c s n2缺失菌株中与氨基酸的合成代谢 相关的基因存在明显表达差异。在中，与支链氨基 酸(b r a n c h e d-c h a i n a m i n o a c i d,B C A A)形成密切相关的基 因/e w A、/e w C和显著下调。能为苯丙氨酸和酪氨酸 的生物合成提供前体的分支酸变位酶（c h o r i s m a t e
m u t a s e,C M)，其编码基因S M L L531下调。在氨酸生物合成中发挥关键作用的氨酸操纵子表达下调。参与精氨酸生物合成途径的ar^C、ar沙和a r g；也同样 下调。而编码半胱氨酸合成酶A的c y s K上调。
C o m E A是一种与
D N A具有高亲和结合力的双位膜 蛋白，能够控制D N A的摄取速率"71，转录组结果显示其编 码基因呈现下调趋势。其他与D N A的复制、重组与修复 相关的基因中，编码C o m Y A、C o m Y B、C o m Y C、C o m Y D、C o m X l的基因同样下调。
此外，对细菌形态、代谢和应激反应具有重要作用的 乙酰基转移酶的基因S M L L1392C和S M L L639明显下调。与生物活性多样化的细菌天然产物——聚酮化合物合成 有关的S M C/_1343c和344c下调。编码胞膜蛋白的 基因S M U_1286c、S M C7_1365c、b a c A2下调。
C R I S P R-C a s系统已被证明参与某些细菌生理的调控，例如
D N A修复、致病性和毒力|181。研究发现在丝裂霉素 C或紫外线辐照诱导的D N A损伤条件下，只敲除C R I S P R1系统C a s蛋白和C R I S P R1、C R I S P R2系统C a s蛋白均被敲除 的变异链球菌菌株存活率均表现大幅下降，证明C a s蛋白 在D N A修复中起到积极作用™。cs/i2基因突变株转录组 结果显示大量与D N A复制、重组和修复的基因表达下调，提示c«i2基因的缺失可能影响变异链球菌的D N A修 复功能。此外，研究发现存在C R I S P R位点的菌株对包括 酸胁迫、氧化胁迫以及高温胁迫在内的环境压力表现出 更好的耐受性|7’191，本课题组前期研究发现c m2基因的缺 失影响变异链球菌耐酸能力，同时转录组结果显示对细 菌应激反应具有重要作用的乙酰基转移酶的编码基因明 显下调，与细菌耐受环境压力有关的控制D N A结合、水 解和重组的基因同样下调。因此合理推测c s n2基因的缺 失可能也对变异链球菌的氧化应激能力以及热应激能力 产生影响。既往研究表明具有两个C R I S P R位点的变异 链球菌形成生物膜并产生胞外多糖的能力显著大于没有 C R I S P R位点的菌株|n l。基因突变株转录组结果显示 大量与碳水化合物的转运和代谢、
能量产生和转化以及
80四川大学学报(医学版)第52卷
氨基酸转运和代谢相关的编码基因差异表达，而这些生 物过程与细菌胞外多糖的产生以及生物膜形成密切相关，这可能解释了前期研究中基因缺失菌株在酸适应后生物膜及胞外多糖合成增加的相关机制。
完整的细胞膜结构及成分是细菌维持正常生命活动 的基础，在细菌的生长代谢以及维持胞内微环境的稳定 方面具有重要作用。对变异链球菌生理学的研究发现细 胞膜在酸碱调节中起主要作用，这些作用包括影响变异 链球菌质子通透性和质子移位膜腺苷三磷酸酶（1^- t r a n s l o c a t i n g a d e n o s i n e t r i p h o s p h a t a s e,H.-A T P a s e)的活 性丨2。-221，以及改变膜相关蛋白和脂肪酸组成丨23丨。本课题组 前期实验结果显示A«n2的细胞膜通透性增强，而转录组 结果中未发现编码质子挤出泵F I F O-A T P a s e的基因有表 达差异，但编码膜脂蛋白的基因S A W_1286c、S M L L1365C、显著下调，另外，与乙酰化和聚酮化合物合成相关 的基因同样表现出下调，推测可能是基因缺失通过
影响乙酰化修饰的过程而改变细菌细胞壁结构和通透性。同时，乙酰化在脂肪酸合成过程中起重要作用1241，而 细菌利用聚酮合成酶途径合成多不饱和脂肪酸是脂肪酸 合成的重要途径之一|251。研究表明膜脂肪酸可以直接影 响脂质双分子层的质子通透性或间接地通过影响H+-A T P a s e活性而影响
质子通透性，进而影响细菌耐酸性|261。在酸性环境下，变异链球菌胞膜不饱和脂肪酸的质量分 数会增加从而降低细菌胞膜的质子通透性以应对环境酸 化1231。基于此，我们推测基因的缺失影响了膜脂蛋白和脂肪酸的合成，导致细菌对低p H值非常敏感且无法降 低细胞内的p H值。
细菌在长期的进化过程中形成了自身面对环境压力 的多种耐受机制。对于变异链球菌的耐酸系统来说，除 了利用F1F0-A T P酶和分子外排泵将质子或酸类物质排 出细胞、改变细胞壁和细胞膜对质子的通透性以外，还可 以通过消耗质子和生成氨来中和胞内质子，防止酸类物 质对生物大分子造成损害|271。在A c s m2中，与B C A A形成 相关的基因;e t M、h C和Z e u D显著下调，此结果被q P C R再 次验证。由于支链氨基酸的合成需要丙酮酸和N A D H的 参与，因此合成支链氨基酸可以消耗丙酮酸和N A D H的同时减少甲酸的含量。而甲酸的酸性强于乳酸和乙酸, 因此B C A A生物合成既可将碳重新导向酸性较低的终产 物，又可通过生成N H3碱化细胞质U81，从而减少酸胁迫对 细胞的损伤。编码精氨酸生物合成的关键酶的基因ar奴和a r g S也下调，精氨酸可以通过精氨酸脱亚氨 酶途径(A D I)代谢产生N H3中和胞内质子，同时产生的 A T P通过A T P a s e将胞内质子栗出细胞外从而显著提高P H|29_M|。这些基因的显著下调可能在中性生长条件下就 赋予A c s n2较低的耐酸性。
口腔链球菌的碳水化合物代谢产酸，在调节口腔环 境p H中起着重要作用™。转录组结果显示，参与形成碳 代谢阻遏（c a r b o n catabolite r e p r e s s i o n，C C R)系统的基因 表达显著变化,P T S和m w i簇表现出显著上调。这些都提 示《«2的缺失导致变异链球菌使用替代性底物和转运方 法进行碳
水化合物代谢，从而影响变异链球菌的能量产 生和酸性终产物的生成。另外，调控乳酸生成过程的主 要基因W/i的转录水平保持不变与前期实验发现4««2的 产酸能力并未表现出明显差异相符合。因此我们推测编 码碳水化合物摄取与代谢系统中的基因表达变化可能达 到动态平衡，因此未检测到酸产生的明显波动，或者存在 冗余机制或转录后调控可以补偿转录组中观察到的基因 表达变化。
综上所述，本研究通过转录组测序联合生物信息学 发现了 c m2基因在变异链球菌中调控的差异表达基因，并且进一步分析了鉴定的差异表达基因可能参与的生物 学过程。《«2基因缺失菌株中大量基因表达量发生了显 著变化，主要集中在碳水化合物的转运和代谢、氨基酸转 运和代谢、能量产生和转化、核苷酸转运和代谢等方面。其中，支链氨基酸合成降低以及细胞膜通透性增高 可能是前期发现A«n2耐酸性下降的主要机制。
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