牛乳中微生物的检测与分析
张月月 刘敏 王荣峰 王君 孙鹏 郭海萌 张帅
（山东农业大学生命科学学院，泰安 271000）
摘要：【目的】了解牛乳的消毒和细菌学检查的重要性，及其卫生质量的判断标准。学习牛乳的巴斯德消毒法和细菌学检查的方法。【 方法】采用显微镜计数法、美蓝还原酶实验法、标准平板计数法进行测定，确定不同来源的生牛乳的等级、 巴氏消毒牛乳的卫生标准。【 结果】 微生物显微镜直接计数法随机性大，对茵体数量不能做出较为宏观， 全面的反应． 优点是计数快速； 美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法， 操作简便， 不需特别设备。它不能做为定量检查； 平板茵落计数法速度慢， 需要平板上长出茵落一段时后才能计数。【 结论】由于平板茵落计数法通常做梯度稀释，所以计数的线性范围大．由于是茵悬液涂布，所以比较均匀， 能较 好的反应茵落的疏密程度。重复性，平行性很好。是经典的计数方法。 关键词：牛乳;微生物;检测;分析
Detection and analysis of microorganisms in milk
Yueyue Zhang，Min Liu，Rongfeng Wang，Jun Wang，Peng Sun，Haimeng Guo，Shuai Zhang
(College of Life Sciences, Shandong Agricutual University, Tai’an, 271000, China)
Abstract:【Purpose】 to understand the milk sterilization and bacteriological examination of importance, and its hygienic quality judgment standard. Learning milk Pasteur disinfection method and bacteriological examination method. 【MEFHOD】 Uses the microscope count the methylene blue reductase method，the standard plating count method to carry on the determination of the number of bacteria，determined different origin the fresh COWS milk rank，pasteurized milk hygienic standard．【RESULTS】Microorgaism microscope direct countmethod 。It has big ran domness cannot make comparatively macroscopic ，overall comprehensive for milk quantity ．But the advantages are coninung and fast for counting of bacteria ；The methyrlene blue reductases method is used in determining the COW'S milk quality．It is simple．No spe
cial equipments needed．But it cannot use for the quantitative examination ；The plating colony count methods is relatively slow，needs the growth of bacteria on the plate and colonies can be counted． 表贴式永磁同步电机【CONCLUSION】Because the plating count method usually makes the gradient to dilution，therefore the counting linear scope is broad ．Because bacterium suspended solution is poured out on the culture of bacterium uniformly ．The bacterial colony density degree can obtain ．The retentiveness，parallelism is very good．It is the classical method of counting bacteria ．
Key words: milk ；microbial ；detection；analysis；
前言
牛乳是一种营养全面的液态天然饮料,含有人体所需的碳水化合物、蛋白质、脂肪、各种矿物质和维生素[1] 。其中的细菌会很快繁殖， 因此，采用不同细菌学检查方法对牛乳中细菌进行卫生检查， 比较得出最佳检测方法， 确定不同来源的生牛乳的等级、 巴氏消毒牛乳
的卫生标准。现今常用显微镜计数法、 美蓝还原酶实验法、 标准平板计数法进行测定， 切入点不同的方法各有优缺。随着人们生活水平的提高,对乳制品的需求亦不断上升。目前国内对乳制品的研究主要集中在发酵酸奶上,但由于国人习惯消费短期内的乳制品,故巴氏杀菌乳在整个消费中仍占主导地位。
牛乳的细菌学检查一般有显微镜直接计数法、检测大肠菌、美蓝还原酶试验和标准平板计数法[2]，现通过试验来了解掌握牛乳的巴斯德消毒方法以及微生物细菌学检测方法,试验通过美蓝还原酶试验和标准平板计数法分别定性、定量检测牛乳样品的细菌数含量，同时通过对照试验，确定在牛乳消毒中被广泛应用的巴斯德消毒法的卫生标准是否达标。
笛膜胶1材料与方法
1.1实验器材
1.1.1培养基和牛乳样品
亚奥特巴氏消毒牛奶样品
亚奥特巴氏消毒变质牛奶样品
牛肉膏蛋白胨培养基：牛肉膏3g 蛋白胨10g 氯化钠5g 琼脂15～20g 水1000ml PH 7.0～7.2 121℃灭菌20nin
1.1.2溶液和试剂
美兰溶液（1：250 000）
1.1.3主要仪器和其他用品
超净工作台，水浴锅，高压灭菌锅，酒精灯，恒温培养箱，9 cm无菌培养皿，无菌18×180mm试管，试管架。无菌250ml三角瓶，无菌棉塞，移液与相应规格的无菌头
1.2试验方法
1.2.1材料预算，培养基配制，无菌水分装，高压灭菌。
1.2.2美兰还原酶试验法
1)标记3个无菌试管1、2、3
2)分别向3个试管中加入10ml不同品牌的生鲜牛乳样品（1号变质亚奥特牛奶，2亚奥特纯牛奶，3号亚奥特纯牛奶）
3)分别向试管中各加入1ml美兰，盖紧管塞
4)轻轻倒转试管约4次，置于37℃水浴中，并记录培养时间
5)测试管在水域中稳定5min中后，取出，轻轻倒转一次后再放回水浴中
6)每隔30min观察记录试管中美兰颜的变化，直至3～6h
1.2.3巴斯德法消毒牛乳
1)将水浴锅的温度调至80℃
2)将牛乳样品用力摇匀，使微生物能均匀分布
3)用灭菌的10ml吸管吸取5ml生牛乳样品放入灭菌试管内，然后将试管放入调好温度的水
浴锅中，水面要超过牛乳表面
4)保持15min，并不时摇动
5)一到15min立刻取出试管，用流水冲试管外壁，使其中的牛乳迅速冷却。
1.2.4标准平板计数法
1)将巴氏消毒的牛乳样品充分摇匀，系列稀释至10-2、10-3和10 -4 。
2)用1ml无菌吸管从三个梯度分别取1ml注入空白平板内
3)各平板倾注约15ml已经融化并冷却至45 ℃左右的牛肉膏蛋白胨培
4)凝固后，倒置于37 ℃培养箱内，培养24h。
5)选择长有30~300个菌落的平板计数，并计算出1ml牛乳中的细菌总数。 6)普通生牛乳样品中的检查同上法，但稀释度为10﹣3 、10 -4和10-5 。
前锁后塞
2实验结果与分析
2.1 实验结果
2.1.1美蓝还原酶试验法结果见表1。
表1 美蓝还原酶试验法结果
| 1号试管 | 2号试管 | 3号试管 |
还原时间/min | 90 | 330 | —— |
牛乳等级 | 四级奶 | 二级奶 | —— |
| | | |
2.1.2 标准平板计数法结果见表2。
表2 标准平板计数法结果
溶液 | 10-2 | 10-3 | 10-4 | 10-5 |
巴氏消毒后牛乳 | 1 | 2 | 0 | 1 | 电梯轨道 ﹨ |
2 | 212 | 168 | 0 | ﹨ |
3 | 196 | 9 | 2 | ﹨ |
未经消毒牛乳 | 1 | ﹨ | 9 | 2 | 10 |
2 | ﹨ | 23 | 3 | 11 |
3 | ﹨ | 30 | 2 | 8 |
| | | | | |
n2200“﹨”表示无该梯度浓度，“——”表示没有菌落。
2.2结果分析
2.2.1美蓝还原试验法
1号试管为变质亚奥特牛奶还原时间为90min，所以牛乳质量为“四级奶”；2号试管为亚奥特纯牛奶还原时间为330min，故牛乳质量为“二级奶”。3号试管为亚奥特纯牛奶未加美蓝溶液，作为观察颜变化的对照实验组。
2.2.2标准平板计数法
从实验结果来看，对于巴氏消毒后牛乳的标准平板计数，平行实验平板间菌落个数不相近，存在误差；梯度浓度间菌落个数差别较为明显。未经巴氏消毒牛乳梯度浓度间菌落数目差别不明显。
3讨论
3.1结果分析
美蓝还原酶试验中三支试管中美蓝的还原时间与牛乳的质量较匹配，实验结果可度较高。而标准平板计数法中由于各种原因导致实验数据较真实情况有较大差异，实验结果不准确，可信度不高。
3.2标准平板计数法试验失败原因分析
1)未做空白平板的对照，导致培养皿菌落数无法对照
2)无菌操作不到位，尤其是在接种和倒平板时，操作未在无菌圈内进行，导致培养皿污染，使实验结果不准确
3)在培养时，未倒置培养
4)由于没搞清楚牛乳中细菌的生长条件，在培养时用报纸包裹培养皿培养，导致实验结果与实际差异较大
3.3 讨论
美蓝还原酶实验法是用于测定牛乳质量的一种定性检测法，操作简便，不需特别设备。它
不能作为定量检查；平板菌落计数法速度慢,需要平板上长出菌落一段时后才能计数。由于平板菌落计数法通常做梯度稀释,所以计数的线性范围大。由于是菌悬液涂布,所以比较均匀,能较好的反应菌落的疏密程度。重复性,平行性很好,是经典的计数方法。
巴氏消毒后1ml牛奶中含菌数不超过30000符合我国消毒牛乳的卫生标准。
未经消毒的牛奶在培养基没长出菌落理论上是不应该的，首先因试验中每支试管中无菌水装了4.5ml烫贴，系列稀释时移液不够长很难吸取前一稀释度的溶液到后一试管，接下来也很难吸1ml稀释的溶液到培养皿进行培养，无法做3个平行，每个稀释度只做了一个平板，而且没做对照，无法确定培养基及操作方面的原因。无菌水少也导致溶液混合不均匀，可能使加入培养皿的溶液含菌数少甚至不含菌。其次，倒此组试验平板的培养基放置时间久，温度降低导致最后在三角瓶的培养基凝成块状，制出的培养基不均匀，不适宜细菌生长。导致平板不长菌落还可能是系列稀释操作时头靠近酒精灯温度高把溶液中的细菌杀死了。
4. 结论
牛乳的细菌学检查方法常用的有显微镜直接记数法、美蓝还原酶实验法、标准平板记数法。显微镜记数法适用于含有大量细菌的牛乳, 生鲜牛乳可用此法检查。如果显微镜检查,每个视野只有1～3 个细菌左右,此牛乳为一级牛乳; 如果牛乳中有很多长链球菌和白细胞,通常来自乳房炎的母牛;若一个视野中有很多不同的细菌,则往往是使用了脏器具保存的牛乳。我国生鲜牛乳的微生物指标规定, 特级牛乳细菌数≤500000个/ml； 一级牛乳≤1000000 个/ml； 二级牛乳≤2000000 个/ml[3～4]。由于该法不够精确,一般不作为消毒牛乳的卫生检查。
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