姜剑巍;杨宇;应春妹
【摘 要】目的：建立乳胶增强散射免疫比浊法检测血清淀粉样蛋白A（SAA）的即时检验（POCT）方法，并对该法的精密度、线性、准确度等进行评价。方法建立乳胶增强免疫比浊法测定SAA的POCT方法，并根据美国临床实验室标准化协会（CLSI ）相关文件对建立的 POCT方法进行方法学评价。结果本法的分析灵敏度为3．52 mg／L；批内变异系数（CV）＜8％、日间CV＜10％；抗干扰性较强，血红蛋白≤4．0 g／L、胆红素≤400μmol／L、类风湿因子≤1621 U／L、甘油三酯≤10 mmol／L 对测定无影响；与进口 N Latex SAA 试剂相关性良好（Y＝1．0521X＋0．0015，r＝0．9983）；线性范围为5～200 mg／L。结论本法具有简单、快速（3 min内完成检测）的特点，各项分析指标均符合要求，可用于临床患者血清标本的检测。%Objective To establish the analysis performance of serum amyloid A (SAA ) detected by latex-enhanced immunonephelometry method with point-of-care test (POCT),and to evaluate precision,linearity,accuracy and so on.Methods According to relevant documents of the Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI),the methodolo gical evaluation was performed.Results The sensitivity of this method was 3.52 mg/L.The within-run and inter-day coefficients of variation (CV) of this method were <8% and <10%,respectively,with strong anti-interference ability.When the level of hemoglobin was ≤4.0 g/L,the level of bilirubin was ≤400 μmol/L,the level of rheumatoid factor was ≤1 621 U/L,and the level of triglyceride was ≤10 mmol/L,there was no influence on the results.There was a good correlation with that of imported N Latex SAA assay (Y=1.052 1X+0.001 5,r=0.998 3). The detection linear range of this method was 5-200 mg/L.Conclusions The latex-enhanced immunonephelometry method for SAA is convenient,and it can be finished within 3 min.Its performance meets the requirements for in vitro diagnostic reagents,and it is suitable for the detection of serum samples in clinical use.
【期刊名称】《检验医学》
【年(卷),期】2015(000)001
【总页数】4页(P49-52)
【关键词】淀粉样蛋白A;血清;乳胶增强免疫比浊法;即时检验
【作 者】姜剑巍;杨宇;应春妹
【作者单位】上海交通大学医学院附属仁济医院检验科，上海200127;上海奥普生物医药有限公司，上海201203;复旦大学附属妇产科医院，上海200011加香
【正文语种】中 文
【中图分类】R446.1
Application evaluation of latex-enhanced immunonephelometry method to determine serum amyloid A JIANG Jianwei1， YANG Yu2， YING Chunmei3. (1.Department of Clinical Laboratory， Renji Hospital， Shanghai Jiaotong University School of Medicine，Shanghai 200127，China; 2.Shanghai Upper Bio-Tech Pharma Co.，Ltd.，Shanghai 201201, China; 3.Obstetrics and Gynecology Hospital of Fudan University, Shanghai 200011, China )
Key words: Amyloid A；Serum；Latex-enhanced immunonephelometry method；Point-of-care test
血清淀粉样蛋白A(serum amyloid A protein ，SAA)是一种急性时相反应蛋白，属于载脂蛋白家族中的异质类蛋白质，相对分子质量约为12 000。在急性时相反应中，经白细胞介素(interleukin，IL)-1、IL-6和肿瘤坏死因子(tumor necrosis factor，TNF)刺激，SAA在肝脏中由被激活的巨噬细胞和纤维母细胞合成，可升高到最初浓度的100～1 000倍。与C反应蛋白 (C reactive protein，CRP) 类似，SAA是反映感染性疾病早期炎症的敏感指标，有助于诊断炎症、评估其活性、监控其活动及。研究表明在病毒感染性急性期，SAA水平明显升高，而CRP升高并不明显，因此SAA是判断病毒感染灵敏而可靠的指标[1-3] 。SAA和CRP联合检测有助于患者细菌感染和病毒感染的鉴别诊断。另外，SAA在诊断病毒感染、肾移植排斥反应患者(特别是进行免疫抑制的患者)以及用肾上腺皮质激素的囊性纤维化患者方面比CRP更敏感[4-6]。
目前，已有许多方法应用于血清SAA的检测，包括放射性免疫检测法、酶联免疫吸附试验、免疫速率散射比浊法和微球捕获酶免疫法等[7]。这些方法具有较好的敏感度和特异性，
可用于自动化分析。但是，目前通过中国食品药品监督管理局(CFDA)审批的SAA试剂盒只有西门子公司一家，难以满足市场需求。为此，我们建立了乳胶增强散射免疫比浊法测定SAA的即时检验(point-of-care testing，POCT)方法，并评价其各项性能指标以及在临床检测应用中的可行性。
1. 试验材料 SAA多抗购自丹麦Dako公司；SAA校准品购自英国国家生物制品鉴定所(National Institute for Biological Standards and Control, NIBSC; NIBSC code:92/680)，使用时稀释至相应浓度；羧化聚苯乙烯乳胶微球由上海奥普生物医药有限公司通过乳液聚合方法制备。
2. 试剂和仪器 西门子BNProspec特定蛋白分析仪及配套N Latex SAA试剂盒由德国西门子公司生产。F1多通道散射免疫浊度分析仪(简称F1免疫分析仪，注册号：沪食药监械(准)字2013第2400203号)由上海奥普生物医药有限公司生产。CP70ME超速离心机由日本日立公司生产。
3. 研究对象 40例患者血清标本来自上海交通大学医学院附属仁济医院门诊及住院患者。
山体滑坡监测系统1. 羧化聚苯乙烯乳胶微球的合成 根据文献[8]的方法合成羧化聚苯乙烯乳胶微球。
2. SAA多抗与羧化聚苯乙烯微球的连接 将1 mL 10%粒径大小为80 nm的羧化聚苯乙烯微球用10 mL 0.1 mol/L 2-N-吗啉代乙磺酸(MES)缓冲液(pH值6.0)稀释，加入10 mg/mL 1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐(EDC)溶液1 mL，活化15 min。加入10 mg/mL N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)溶液1 mL，室温下反应1 h，以64 400×g离心1 h，去上清，沉淀用0.05 mol/L磷酸盐缓冲液(phosphate buffered saline，PBS; pH值7.2)悬浮并超声分散均匀。5 mg SAA多抗用0.05 mol/L PBS(pH值7.2)稀释后加入到超声分散好的羧化聚苯乙烯乳胶微球溶液中，室温下反应24 h，用封闭缓冲液[0.05 mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris，pH值8.0)、0.5%牛血清白蛋白(bovine serum albumin，BSA)]封闭1 h，64 400×g离心，用洗涤缓冲液[0.05 mol/L Tris溶液(pH值8.0)]洗涤2次，64 400×g离心，去上清，沉淀部分用30 mL恢复液[0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]恢复，超声分散均匀得到包被了SAA多抗的乳胶微球，即为试剂2。测定校准品，根据测定值在仪器上的反应性能，调整PEG6000的含量，配制成相应的试剂1[除PEG含量调整外，其余配方为0.05 mol/L PBS(pH值7.2)]。
3. 标准曲线的确定 SAA高值血清分别稀释到5、10、50、100、150、200和250 mg/L，每个浓度测定3次，取平均值与仪器检测值做标准曲线。
数据销毁
4. 操作步骤的确定 在比杯中预先分装500 μL试剂1，加入5 μL测试样品，然后加入85 μL试剂2，混匀，在5 s内将比杯插入F1免疫分析仪中，仪器自动识别比杯的插入并开始自动检测，每10 s测定一次散射值，取70 s和10 s散射值的差值与样品浓度做标准曲线。1. 分析灵敏度试验 参考美国临床实验室标准化协会(Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI)EP17-A文件[9]，以零参考标准品(0 mg/L)测定散射值10次，计算其均值和标准差(s)。以散射值的计算得出的值代入标准曲线方程，所得的浓度值即为检测的灵敏度。
2. 精密度试验 根据CLSI EP5-A2文件对于精密度评价的要求[10]，分别测定低、中、高值SAA浓度，2 h内各水平连续测定20次，计算变异系数(coefficient of variation，CV)。每天测定1次， 连续测定20 d。 计算和CV。
3. 准确度 回收试验根据文献[11]配制系列浓度回收血清样品，每份样品测定3次，结果取其平均值，计算回收率。
脉动测速
4. 干扰试验 向正常人混合血清中加入不同浓度胆红素(bilirubin，Bil)、甘油三酯(triglyceride，TG)、血红蛋白(hemoglobin，Hb)，评价检测方法抗黄疸、脂血、溶血干扰的能力。另外加入对比浊法试剂影响较大的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，评价检测方法对RF的抗干扰能力。Bil和TG为纯品，购自国药集团化学试剂有限公司，使用二甲基亚砜(dimethyl sulfoxide，DMSO)溶解后与正常人血清混合。RF和Hb样品来自上海交通大学医学院附属仁济医院住院患者，其RF和Hb浓度经西门子BNProspec特定蛋白分析仪和配套试剂盒测定得到。
5. 对比试验 将40例收集的临床血清随机分成5组，每天用本法和N Latex SAA试剂分别测定1组(8份)血清样品，每份血清样品测定2次，连续测定5 d，每种方法得到80个数据[12]。
6. 线性范围测定 按照CLSI EP6-P文件做线性评价。取一高浓度标准品(200 mg/L)和一低浓度标准品(5 mg/L)，然后把两份样品等体积混合产生中间浓度值的样品，再分别将中间浓度值的样品和高低浓度值的样品混合，共产生了5个浓度值的样品。在F1免疫分析仪上用本法对5个不同浓度的样品分别平行测定5次，对数据进行统计处理，得到该检测方法的线性范围。
采用SPSS 10.0和Microsoft Excel 2007软件进行统计分析。采用配对t检验对两种方法的SAA结果做回归和相关性分析。P<0.05为差异有统计学意义。
乳胶片1. 基本特性 由于在F1免疫分析仪中的检测时间只有70 s，加上加入样品和试剂2的时间，单个样品的检测时间总共不超过3 min。
2. 标准曲线 标准曲线公式为一元二次方程Y=-0.251X2+126.7X+87.89，R2=0.998，见图1。该曲线为SAA浓度为0～250 mg/L时的标准曲线；当样品SAA>250 mg/L时，需将样品稀释后再测。
1. 分析灵敏度 零参考标准品测定10次的平均值加上2倍的标准差所得值为530.76，将其作为Y值代入标准曲线方程，得X值为3.52。所以本法的分析灵敏度为3.52 mg/L。
分丝辊
2. 精密度 批内精密度和日间精密度结果见表1。
3.回收试验 本法的回收率为93.21%。
4.干扰试验 Bil≤400 μmol/L、Hb≤4.0 g/L、TG≤10 mmol/L、RF≤1 621 U/L对本法测定SAA无影响。见表2。
5. 对比试验 方法学比对结果显示本法和N Latex SAA试剂测定40例患者SAA的检测值主要落在5.12～185.67 mg/L之间。两种方法的相关系数(r)=0.998 3，P>0.05，见图2。对两种方法的测定数据进行Bland-Altman分析，结果见图3。从图3可以看出，有10%(4/40)的点在95%一致性界限以外；在一致性界限以内，两种方法差值的最大值为9.21 mg/L，两种方法测定结果的平均值为50.81 mg/L。这种相差的幅度在临床上可以接受。因此两种方法测定的结果具有一致性，在临床上可以互相替代使用。
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