(19)国家知识产权局
(12)发明专利申请
(10)申请公布号 (43)申请公布日 (21)申请号 202210559172.7
(22)申请日 2022.05.22
(71)申请人 上海交通大学
地址 200030 上海市徐汇区华山路1954号
(72)发明人 崔大祥 张春雷 牛嘉琪 倪健
(74)专利代理机构 上海东亚专利商标代理有限
公司 31208
专利代理师 董梅
(51)Int.Cl.
A61K 49/04(2006.01)
A61K 49/08(2006.01)
A61K 49/10(2006.01)
A61K 49/18(2006.01)
(54)发明名称
备及其产品和应用
(57)摘要
本发明涉及一种叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团
括：MHA为配体的金纳米团簇的合成和纯化，氯化
锰(MnCl 2)四水合物溶于水中配置MnCl 2母液，采
用锰离子(Mn 2+)诱导MHA为配体的金纳米团簇自
组装成纳米颗粒，并在表面共价偶联叶酸分子，
制备得到叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装
体。本发明方法获得的产品用于胃癌消化道肿瘤
的MRI成像和CT成像检测。权利要求书2页 说明书5页 附图2页CN 115105610 A 2022.09.27 C N 115105610
A
1.一种叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于：采用锰离子(Mn 2+)诱导金纳米团簇静电自组装，与叶酸分子共价偶联相结合构成叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体，包括如下步骤：
金纳米团簇的制备步骤：以6‑巯基己酸MHA作为巯基配体制备的金纳米团簇，将MHA配体保护的金纳
锰离子(Mn 2+)溶液制备步骤：将包括氯化锰(MnCl 2)四水合物的锰离子(Mn 2+)溶于去离子水中，配成溶液B，超声后备用；
锰离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤：将溶液B缓慢滴加入溶液A中，添加的锰离子(Mn 2+) 离子和金纳米团簇的摩尔比1.2:1‑2:1，诱导MHA配体保护的金纳米团簇自组装成金纳米团簇组装体；
叶酸分子共价偶联到金纳米团簇组装体的步骤：将金纳米团簇组装体采用EDC/NHS进行活化，将活化的金纳米团簇组装体与叶酸分子的氨基进行偶联，得到叶酸修饰的Mn ‑Gold 纳米团簇自组装体。
2.根据权利要求1所述的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于，所述金纳米团簇的制备步骤中：MHA配体和金原子的摩尔比例为1.5：1，将制备的金纳米团簇溶于6.2 < pH < 7.0的去离子水中，得溶液A。
3.根据权利要求1所述的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于，所述锰离子(Mn 2+)溶液制备步骤中：锰离子(Mn 2+)溶液为新鲜配置的溶液，锰离子(Mn 2+)溶于pH范围6.2 < pH <7.0的去离子水中，100W超声2‑3 min 得溶液B备用。
4.根据权利要求1或3所述的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于，所述锰
离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中：溶液A与溶液B的体积比为4: 1，将新鲜配置的溶液B按约400μL/min速度缓慢滴加入溶液A中，添加的锰离子(Mn 2+) 离子和金纳米团簇的摩尔比1.26:1，1500rpm/min 快速涡旋30s ‑1min，随后在25‑30℃水浴锅中，1300rpm/min 搅拌3h～6h。拉画笔
5.根据权利要求1所述的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于，所述叶酸分子共价偶联到金纳米团簇组装体的步骤中：
在pH 5.4的MES缓冲液中采用EDC/NHS对金纳米团簇的组装体的羧基进行活化，然后与叶酸分子的氨基进行共价偶联；或者
在MES缓冲液中采用EDC/NHS对金纳米团簇的组装体的羧基进行活化，然后与叶酸分子的氨基进行共价偶联。
6.根据权利要求1或2所述的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，其特征在于，所述的金纳米团簇的制备步骤包括：
（1）金纳米团簇的制备：将MHA配体保护的金纳米团簇溶于去离子水中；
新鲜配置8 mM/mL的HAuCl 4溶液和150 mM/mL的MHA 溶液，加入到43.5 mL低于室温的冷超纯水中，室温200 rpm/min搅拌3 min，形成了白的Au(I)–MHA不溶物的混合物；低于室温的冷硼氢化钠(
NaBH 4)溶液，按摩尔比：NaBH 4/Au = 8.3：1加入上述混合物中剧烈搅拌5 min，1M NaOH调整pH值到≈7.0，继续剧烈搅拌 3h，形成MHA配体包覆的金纳米团簇；
（2）金纳米团簇的纯化：收集合成的金纳米团簇粗液，加入三倍体积的无水乙醇，再加入NaCl溶液，其最终浓度约为10 mM，待整个混合溶液出现浑浊后，5000 g/min，离心10min，
去掉上清液，沉淀溶于去离子水中形成溶液A，备用。
7.一种叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体，根据权利要求1至5任一项所述的方法制备得到的。
8.一种根据权利要求7所述叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体在制备消化道肿瘤的多模态成像造影剂和探针中的应用。
9.根据权利要求8所述叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体在制备消化道肿瘤的多模态成像造影剂中的应用，其特征在于，其以金纳米团簇经由锰离子诱导组装成的纳米组装体为核，再在其表面共价偶联叶酸分子，共同构成兼具MRI和CT造影效果的纳米影像探针制剂，作为胃癌模型的多模态成像造影剂，或纳米影像探针。
10.根据权利要求8所述叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体在制备消化道肿瘤的多模态成像造影剂中的应用，其特征在于，所述的纳米影像探针以消化道肿瘤为靶向，用于消化道肿瘤成像检测中，将
毛竹片制备的纳米影像探针通过口服，靶向到消化道肿瘤部分，利用MRI 成像设备与CT设备实现消化道肿瘤的双模态成像检测，以发现消化道肿瘤及定位。
叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体的制备及其产品和
应用
技术领域
硼硅酸盐玻璃
[0001]本发明属于分子影像诊断领域。涉及一种叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体的制备及其产品和应用。本发明产品尤其是针对叶酸受体的靶向成像纳米探针方面的应用。
背景技术
[0002]磁共振成像（MRI）是利用图像重建技术将磁场中原子核共振产生的电磁信号转化为物体体内信息的一种成像技术。它可以在任何方向上显示物体的密度、空间分布、断层图像和三维图像等。核磁成像用于肿瘤的分子影像学诊断离不开成像造影剂的辅助。一般常用的MRI弛豫增强试剂都是含钆类的化合物，因为钆具有很强的顺磁弛豫增强能力。目前临床上常用的T1加权成像造影剂多采用三价钆离子，但是钆类对比剂有可能引起性系统性纤维化，因此钆类对比剂的使用也具有一定的局限性。为降低钆离子的生物毒性，多采用二乙基三胺五乙酸之类的螯合剂进行配位螯合，降低其毒性。
该方法不仅合成方法繁琐而且成本高。
[0003]此外，锰也是一种顺磁性金属，其毒性非常低，是生物体内一种必须的元素，二价的锰离子有5个未成对电子，也具有较强的弛豫增强效果，锰离子已经作为MRI对比剂广泛的用于MRI动物实验中。另外，锰对比剂的存在形式比较多样化，比如锰盐、小分子有机螯合物、大分子螯合物、氧化物纳米粒子等，并且锰对比剂毒性相对较低，因此在使用时可以较大剂量的使用。
[0004]胃癌是常见的消化道恶性肿瘤，叶酸受体在70%胃癌组织中高表达，设计制备针对叶酸受体的靶向成像纳米探针，具有临床需求。MRI成像与CT成像是临床常见的两种成像模式。锰离子可用作T1加权造影剂。由于金原子较高的原子序数（Z=79）前期研究表明金纳米团簇能够用于CT成像。但是如何制备针对叶酸受体的靶向成像纳米探针，将锰离子(Mn2+)结合到纳米材料中，实现具有靶向效果的MRI与CT双模态成像未见报导。
发明内容
[0005]本发明目的在于提供一种简单，高效，低成本的叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，以降低产品的生物毒性。
[0006]本发明的再一目的在于提供上述方法获得的叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体产品。
[0007]本发明的又一目的在于提供所述产品的应用。
滚动鼠标[0008]本发明目的通过下述方案实现：一种叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体的制备方法，采用锰离子(Mn2+)诱导金纳米团簇静电自组装，与叶酸分子共价偶联相结合构成叶酸修饰的Mn‑Gold纳米团簇自组装体，包括如下步骤：
金纳米团簇的制备步骤：以6‑巯基己酸（6‑Mercaptohexanoic acid,MHA）作为巯
基配体制备金纳米团簇，该金纳米团簇粒径均一、光学性质稳定、水溶性好，将MHA配体保护的金纳米团簇溶于去离子水中，形成溶液A；
锰离子(Mn 2+)溶液制备步骤：将包括氯化锰的四水合物（MnCl 2·4H 2O）的锰离子(Mn 2+)溶于去离子水中，配成溶液B，超声后备用；
锰离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤：将溶液B缓慢滴加入溶液A中，添加的锰离子(Mn 2+) 离子和金纳米团簇的摩尔比1.2:1‑2:1，诱导MHA配体保护的金纳米团簇自组装成金纳米团簇组装体；
叶酸分子共价偶联到金纳米团簇组装体的步骤：将金纳米团簇组装体采用EDC/NHS进行活化，将活化的金纳米团簇组装体与叶酸分子的氨基进行偶联，得到纳米颗粒分布均匀的叶酸修饰的Mn ‑Gold纳米团簇自组装体。
[0009]本发明提供一种锰离子(Mn 2+)诱导金纳米团簇自组装成纳米组装体的方法，采用快速，高效，简易的方法，利用锰离子(Mn 2+)以及金纳米团簇MHA配体之间的静电相互实现自组装，组装成较大的纳米组装体，不需螯合剂进行配位螯合，并在其表面偶联靶向分子叶酸。整个制备步骤简单，没有复杂程序，生产的产品低毒性、低成本。
膜盒
[0010]优选地，所述金纳米团簇的制备步骤中：MHA配体和金原子的摩尔比例为1.5：1，金纳米团簇溶于6.2 < pH < 7.0的去离子水中。
[0011]优选地，所述锰离子(Mn 2+)溶液制备步骤中：
锰离子(Mn 2+)溶液为新鲜配置，锰离子(Mn 2+)溶于pH范围6.2 < pH <7.0的去离子水中，100W超声2‑3 min 后备用。
[0012]优选地，所述锰离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中：添加的锰离子(Mn 2+) 离子和金纳米团簇的摩尔比为1.5:1。两者的摩尔比低于1.2:1则锰离子(Mn 2+) 的量不足金纳米团簇不能组装成分散的颗粒，比例高于2:1则锰离子(Mn 2+)的量太高，容易造成团聚。
[0013]本发明中pH值的大小对锰离子(Mn 2+)以及金纳米团簇之间的静电相互作用影响很大，间接的影响金纳米团簇的自组装。
吸咪头
[0014]优选地，所述锰离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇的自组装步骤中：溶液A与溶液B的体积比为4: 1。
[0015]本发明中金纳米团簇溶液浓度可以为1.5mg/mL，锰离子(Mn 2+)的浓度根据加入的金的总量来计算。
[0016]本发明的机理是：把锰离子与金纳米团簇组装在一起，可以实现MRI与CT双模态成像，叶酸受体在消化道肿瘤如胃癌、肠癌等肿瘤组织中高表达，把叶酸与上述金纳米团簇组装体进行偶联后，可以实现叶酸受体高表达的胃癌等消化道肿瘤的特异性识别与结合。
[0017]锰离子(Mn 2+)诱导的金纳米团簇组装体采用EDC/NHS联用进行活化，可将金团簇的表面MHA配体的羧基活化成活泼的琥脂类，可以与叶酸分子的氨基进行共价偶联，形成酰胺键。其中EDC为(1‑乙基‑3‑(3‑二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐)，NHS为N ‑羟基琥珀酰亚胺。
[0018]优选的，对所述的金纳米团簇组装体进行纯化，采用葡葡聚糖凝胶层析Sephadex G ‑150以及去离子水作为平衡液来纯化制备得到的金纳米团簇组装体。
[0019]本发明还提供了上述制备方法获得的叶酸修饰的Mn ‑Gold 纳米团簇自组装体产品，充分发挥锰离子(Mn 2+)以及金纳米团簇的优良性质。为MRI与CT双模态成像提供了新的
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