第六章原生质体培养和体细胞杂交
一、原生质体培养的意义与研究概况
原生质体（protoplast，PPT）: 用机械或酶解法去掉细胞壁的裸露细胞。
1. 原生质体培养的意义与研究概况
1.1 培养意义
1）体细胞杂交；作物遗传改良，这是一种新的远缘杂交方法，为人们提供新的育种方法。两个亲缘关系较远的植株用一般杂交方法是不容易成功的，而用细胞融合的方法却成为可能。 2）遗传转化的受体，避免嵌合体；
3）突变体筛选：体细胞无性系变异+ 离体诱变；
4）基础研究：细胞壁再生、膜结构、跨膜运输、病毒侵染、抗寒性、抗热性等；
5）种质资源超低温保存，并可研究低温伤害与胞内结冰等；
6）细胞器和大分子分离。
1.2 研究概况
1880，Hanstein, 提出原生质体；
1892，Klercker, 机械法分离少量原生质体；
1960，Cocking，纤维素酶分离番茄幼根，得大量活性原生质体，奠基；
1968，纤维素酶和离析酶上市，迅速发展；
1971，Takebe，酶解分离烟草叶肉原生质体，再生植株；
1985，Fujimura等，世界第一例禾谷类作物，水稻原生质体再生植株；
1986，通过甘蓝型油菜单个原生质体培养获得再生植株。单个原生质体培养成功；
至1999，46科、161属、368种高等植物，原生质体再生植株，但若干重要作物仅限于少数基因型，再生率不高，培养基和培养程序复杂，规律少。
二、原生质体的分离与纯化
2.1 原生质体分离
2.1.1 原则：大量、避免损伤，高活力，能进行分裂并形成愈伤组织或胚状体是原生质体培养成功的基础。
取材：叶片，愈伤组织，悬浮细胞喷墨打印机墨水>物理教具制作
2.1.2分离方法：
1）机械法: 用解剖刀切碎质壁分离的组织，再通过质壁分离[pl?z’m?lisis]的复原释放出原生质体。
优点：物理损伤，排除了外加酶的有害影响。
缺点：产量低，操作不便，只限于能发生质壁分离的组织（适于高度液泡化细胞，不适于分生组织）；费时费力。
补充：
细胞壁组成：
a. 胞间层middle lamella：位于两个相邻细胞之间，为两相邻细胞所共有的一层膜，主要成分为果胶质。
b. 初生壁The Primary Wall：位于胞间层内侧。主要成分为纤维素、半纤维素，
c. 次生壁secondary wall：位于质膜和初生壁之间。主要成分为纤维素，并常有木质存在。2）酶解法：常用混合酶液一步完成，广泛应用。
叶肉细胞、愈伤组织和悬浮细胞,
缺点：不纯的酶制剂可能对原生质体有害。
2.1.3分离原生质体的酶液组成
1）细胞壁组成：纤维素25%~50%，半纤维素53%，果胶质5%。
2）酶液的组分及其作用：以最少品种和最少量，但能分离得到健康的原生质体为准。纤维素酶和果胶酶为必需酶。一般叶片用纤维素酶和果胶酶；愈伤组织或根再添加半纤维素酶。
纤维素酶：必需，降解纤维素，
果胶酶：必需，降解果胶质，
离析酶：降解果胶质，
半纤维素酶降解半纤维素，
蜗牛酶或胼胝质酶：降解小孢子壁（胼胝质）；
崩溃酶：兼具纤维素酶、果胶酶等酶活；
3）渗透稳定剂：促进酶解作用，保持原生质体的完整性，使既不涨破又不因过分收缩而破坏内部结构。
糖醇系统:甘露醇、山梨醇、葡萄糖和蔗糖
甘露醇：调节渗透压，应高于原生质体，0.3~08M；
盐类系统:CaCl2、MgSO4、KCl 和葡聚糖硫酸钾
CaCl2：稳定质膜，提高活力；
KH2PO4/葡聚糖硫酸钾：稳定质膜，提高活力；
MES（2,N-氮吗啉-乙基磺酸）：稳定pH；
pH：5.6~5.8。
2.1.4常用CPW液(细胞-原生质体清洗液)配制酶液和洗涤液。
CPW液的组成：
KH2PO4 27.2mg/L
KNO3 101.0mg/L
CaCl2·2H2O 1480.0mg/L
MgSO4·7H2O 246.0mg/L
KI 0.16mg/L
CuSO4·5H2O 0.025mg/L
pH 5.8
2.1.5 用酶法制备原生质体的程序
从带菌叶片分离：
预处理→(表面消毒→去表皮/擦伤/切碎)→酶解分离(25~30℃)，避光，静置或间断低速震荡，30min~20 h) →纯化。
从无菌苗、愈伤和悬浮细胞分离：省去消毒和去皮。
预处理：主要目的是便于原生质体分离和促进细胞分裂, 高渗hypertonic [haip?'t?nik] 、激
素、低温等。
去表皮或擦伤：利于酶液渗入和PPT释放。
刺辊2.1.6 酶解条件
最主要的是酶处理时的温度和pH。
不同的酶需要的pH值不一样，但pH大于6时不利于原生质体生存。
酶解时间因材料而不同，以原生质体游离下来为准。一般不要超过24h，时间太长不利于原
生质体培养，对以后培养中的细胞生长和分裂有影响。
酶解温度一般为25~27℃。
一般在黑暗中进行，叶片分离原生质体可在静置条件下进行，悬浮细胞由于壁厚，培养（分离）过程中间断低速震荡有利于酶渗透。
2.2 原生质体的纯化
经酶解处理后，得到的混合物是一个由原生质体、细胞团与细胞碎片等组成的混合液，只有将杂质和酶液去掉，使原生质体纯化，才能进行培养。
2.2.1目的：去除细胞团、细胞碎片、酶液。
循环水旁滤器2.2.2方法：过滤和离心相结合。微波电视天线
a. 收集：用孔径40~100μm的不锈钢网stainless steel net 、尼龙网nylon net 、镍丝网wire netting of nickel过滤收集；
b.洗涤：将网下物低速离心,去掉上清液,再加无酶液的CPW液悬起原生质体,再离心,弃上清,重复几次即可.CPW液在500~800 rpm离心洗涤；
用培养基纯化。
d. 方法：
上浮法: 将酶解的原生质体与蔗糖溶液（23%左右）混合，混有较多叶片及少量老细胞时，适用于高度液泡化的细胞
下沉法: 将原生质体与13%的甘露醇混合，
界面法:将原生质体与13%的甘露醇混合，然后加到23%的蔗糖溶液顶部，形成一个界面。两种方法中，均在500-1000rpm下离心5-10分钟，会在蔗糖溶液顶部或者甘露醇溶液底部形成一条原生质体带。
2.3 原生质体的活力检测
方法：活体染、观察胞质环流、测定呼吸强度等。
活体染：
1) 伊凡蓝(Evans)染：质膜完好者燃料不能进入，损伤者染。
连续缠绕玻璃钢夹砂管
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