两种不同淋巴细胞分离液对脐带⾎单_省略_取及后期诱导培养CIK细胞的影响_张校通 ⽣命科学仪器 2011 第9卷/10⽉刊
研究简报
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摘要⽬的：研究两种不同的淋巴细胞分离液对脐带⾎单核细胞的分离效果及后期对CIK 细胞的诱导培养的影响。⽅法：分别使⽤国产TBD 以及进⼝GE healthcare 牌淋巴细胞分离液分离提取脐带⾎单核细胞，⽤悬浮细胞培养法诱导培养脐带⾎单核细胞形成CIK 细胞，再⽤⾎球计数板及台盼兰染⾊法检测细胞密度及活率。结果：国产的TBD 牌所分离的单核细胞分层较清楚，并且⽅便提取，⽽使⽤进⼝GE healthcare 的淋巴细胞分离液提取的单核细胞数量较多，但经过后期诱导培养CIK 细胞发现两种分离液提取的细胞培养到后期数量逐渐接近。结论：国产TBD 牌淋巴细胞分离液在⽤于脐带⾎淋巴细胞分离提取时较进⼝GE healthcare 牌经济，并且细胞提取⽅便，后期培养效果⽆明显差别。关键词淋巴细胞分离液；脐带⾎；单核细胞；CIK 细胞 两种不同淋巴细胞分离液对脐带⾎单核细胞的提取及后期
诱导培养CIK 细胞的影响张校通*，赵令卉，王⼩燕，王翔，申重阳，郑榆坤
（成都清科⽣物科技有限公司，成都，610000）
作者简介三排键
第⼀作者简介：张校通（1984-），男，主要研究⽅向为细胞免疫。Tel：152********，E-mail：
zhangxtwl@/doc/b99395412.html
脐带⾎单核细胞是较为常见的⼀类细胞，⽤途较为⼴泛，内含丰富的造⾎⼲细胞、间充质⼲细胞等，且分离的脐带⾎单核细胞经过诱导成为在肿瘤的防治中具有重要作⽤的CIK（Cytokine-Induced Killer, CIK）细胞。如何保证提取脐⾎单核细胞的质量，减少对后期细胞培养的影响，成为单核细胞提取过程中共同关注的话题。淋巴细胞分离液的选择不仅决定着单核细胞分离的效果，⽽且对后期CIK诱导培养也有着重要的影响。为了在达到理想的分离提取效果以及尽可能节约实验成本，我们通过使⽤两种不同品牌的淋巴细胞分离液，观察使⽤两种不同分离液对脐带⾎单核细胞分离效果及对后期培养的影响，为进⼀步研究脐⾎来源CIK的⽣物学特性奠定实验基础。
1 材料与⽅法
1.1 仪器和试剂
主要仪器及耗材：离⼼机（湖南湘麓公司）；⽣物安全柜（珠海市再鑫仪器有限)；细胞培养箱（三洋公司）；离⼼管（CORNING）；移液（fastpette）；注射器(新叶牌）；移液管（CORN-ING）；T175培养瓶（CORNING）；普通显微镜（奥林巴斯公司）；⾎球计数板（求精公司）。
主要实验试剂：PBS（Hyclone）；ficoll淋巴细
胞分离液（GE healthcare）；TBD淋巴细胞分离液（天津市灏洋⽣物科技有限公司）；细胞培养基（Hyclone）。1.2 ⽅法1.2.1 脐带⾎单核细胞的提取
接收到经产妇同意采集的四份脐带⾎后，将其编为1、2、3、4号，各份⾎样平均分成两份放⼊离⼼管内离⼼，根据液体的量加⼊两倍体积⽣理盐⽔混匀。然后分别以1.5∶1的⽐例缓慢等量加⼊两种淋巴细胞分离液然后离⼼，吸取中间的⽩细胞层进⼊离⼼管，根据吸⼊液体的量加⼊PBS，将细胞和PBS 混匀、离⼼。进过两次PBS洗涤后⽤移液管吸取弃掉离⼼管上⾯的PBS，保留离⼼管底部的细胞。记录细胞的密度及活率。
1.2.2 脐带⾎单核细胞的诱导培养
把⽤两种不同淋巴细胞分离液提取的脐带⾎单核细胞分别装⼊T175的培养瓶⾥，然后加⼊25mL的诱导液，把细胞摇匀后放⼊37℃⼆氧化碳浓度5%的培养箱进⾏诱导培养。在细胞培养期间，根据细胞
的⽣长密度经两种分离液提取的细胞定期加⼊或弃掉相同的培养液。在细胞培养的第0、4、8、12、16、20天取样进⾏细胞活率及密度的测定。观察两种不同培养液提取细胞对后期培养的影响。1.2.3 细胞密度及活率的测定
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A管为国产TBD牌淋巴细胞分离液分离提取后经
PBS清洗离⼼得到的效果；B管为⽤进⼝GE healthcare
活塞销淋巴细胞分离液分离提取后经PBS清洗离
A是⽤国产的TBD淋巴细胞分离液提取的结果；B
是⽤进⼝的GE healthcare淋巴细胞分离液提取的结果。中空板封边机
2.2 单核细胞经诱导培养后CIK细胞的密度及活率
2.2.1 CIK细胞的密度
由表1可以看出，⽤GE淋巴细胞分离液提取的单
核细胞数量⽐⽤TBD淋巴细胞分离液提取的多。但
实验也表明⽤GE淋巴细胞分离液提取的单核细胞中
红细胞⽐较多。在后期的诱导培养中，可以看到两
种⽅法离细胞的密度逐渐的接近。
2.2.2 CIK细胞的活率
由表2可以看出，⽤TBD淋巴细胞分离液提取的（1）密度测定：将⾎球计数板及盖⽚⽤绸缎
布擦拭⼲净，并将盖⽚盖在计数板上。将7~10µL细胞悬液滴加在盖⽚边缘，使悬液充满盖⽚及计数板间。静置1min后镜下观察，计算计数板四⼤格细胞总数。
细胞数/mL = 4⼤格细胞总数/4×稀释倍数×10000（2）活率测定：将细胞悬液0.5mL加⼈E p管中，加⼊等量的0.4%台盼兰染液，染⾊2~3min。取7~10µL悬液涂于载破⽚上并加上盖⽚，镜下取任意视野分别计死细胞及活细胞数，计算细胞活率。
细胞活率=活细胞数/ (死细胞数+活细胞数)
2 结果
2.1两种分离液的提取效果及⽐较
脐带⾎分别加⼊两种不同分离液离⼼后，管中内容物分为3个清晰的层⾯：上层为⾎浆(内含⾎⼩板)，中间层为分层液，底层为红细胞和多形核⽩细胞[1]。在上层清晰的橙红⾊液体与中层清亮透明液体交界处可清楚地见到环状乳⽩⾊的层⾯，即为脐带⾎单核细胞层（如图1）。GE淋巴细胞分离液分离的细胞数量较多但明显含有较多红细胞，⽽国产TBD 淋巴细胞分离液中红细胞较少。离⼼洗涤后，可以看到A管中沉淀到底层的红细胞⽐B管中红细胞少很多（如图2）。显微镜观察结果也表明GE 淋巴细胞分离液提取出的脐带⾎单核细胞⽐TBD淋巴细胞分离液提取出的数量较多，但其中含有⼤量的红细胞（如图3）。
A管为国产TBD牌淋巴细胞分离液分离后的效果；B管为⽤进⼝GE healthcare淋巴细胞分离液分离
后的效果。图1 两种分离液的提取效果
ome 103
图2 PBS清洗离⼼后效果
图3 提取细胞显微镜下观察图⽚
A B
表1 两种分离液提取单核细胞的密度
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化学浆糊
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单核细胞与⽤GE淋巴细胞分离液提取的单核细胞活率接近，都可以达到90%以上，两种分离液分离细胞在后期培养中⽆明显差别。
3 讨论
脐带⾎单核细胞是⼀种⽤途⾮常⼴泛的细胞，可以分化为多种细胞，经过诱导成为CIK细胞是⼀种新型的免疫细胞。与传统免疫细胞相⽐，CIK细胞对肿瘤具有更强⼤的体内外杀伤活性[2]。它主要由CD3+CD56+和CD3+CD8+组成，其兼具T细胞的抗瘤活性和⾃然杀伤细胞⾮MHC限制性杀瘤作⽤。抗瘤性⾼于淋巴因⼦激活的杀伤细胞[3]。临床应⽤表明CIK细胞对肿瘤患者微⼩残留灶有较好疗效[4]，在结合抗原呈递细胞进⾏肿瘤特异性[5]、基因[6]等⽅⾯有更深⼊的临床研究价值。所以，对脐⾎单核细胞提取的质量要求极为严格，本试验通过⽐较验证了不同淋巴细胞分离液对细胞分离效果及对后期培养的影响。试验结果表明，两种淋巴细胞分离液的分离效果及后期诱导培养CIK细胞的影响，我们发现国产的TBD淋巴细胞分离液和进⼝的GE淋巴细胞分
离液相⽐，前者离⼼后分层更清楚，提取更⽅便。
表1 两种分离液提取单核细胞的密度
虽然提出的单核细胞的量要⽐进⼝的GE淋巴细胞分离液提出的少⼀些，但后者⾥⾯所掺杂的红细胞较多，且随着后期培养⼆者⽆论在细胞密度还是活率上都已⼗分接近，⽆疑在此实验中使⽤TBD分离液⽐较经济实惠。
通过实验，为脐⾎单核细胞提取实验中淋巴细胞分离液的选择提供了参考，并且通过对肿瘤有杀伤作⽤的CIK细胞的诱导培养验证了对后期培养的影响，也为肿瘤疾病的预防和提供了⼀定的实验基
础。
参考⽂献
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Effect of Two Different lymphocyte Separatory Liquids on the Extraction
of Umbilical Cord Blood mononuclear cells and
Later Induction Culture of CIK Cells
ZHANG Xiao-tong*, ZHAO Ling-hui, WANG Xiao-yan, WANG Xiang, SHEN Chong-yang, ZHENG Yu-kun
(Qing Ke Biological Technology Limited Company, Chengdu 610000, China)
Abstract Objective: To compare the result of umbilical cord blood mononuclear cells extracted by two different lympho-cyte separation liquids, and the later effect on CIK culture. Methods: The improved methods were used to extract mono-nuclear cells from umbilical cord blood. Then the mononuclear cells were inducted and cultured to CIK cells. Lastly, the blood corpuscle count plate and trypan blue were used to determination the density and live rate of CIK cells. Results: Compared with the GE healthcare, the quantity of mononuclear cells separated by TBD was less, while the stratification was clearer and more convenient to extract. Besides, when the cells cultured to CIK later, their density and live rate were close gradually.
Conclusion: The TBD lymphocyte separation fluid was more economical and convenient than GE health-care when used to separate mononuclear cells from umbilical cord blood; in addition, there were no significant difference on later culture. Keywords The lymphocyte separation fluid; Umbilical cord blood; mononuclear cells; CIK cells
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