钟表齿轮山东农业大学
硕士学位论文
姓名：***
申请学位级别：硕士
专业：动物遗传育种与繁殖
指导教师：***
2002.5.1
山东农业大学硕士研究生论文（２００２）
英文缩略词
ＥＳｃｅｌｌｓ：ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ
ＥＧｃｅｌｌｓ：ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＧｅｌＴｎＣｅｌｌｓ
ＥＣｃｅｌｌｓ：Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ—ＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌｓ
ＣＥＳｃｅｌｌｓ：ＣｈｉｃｋｅｎＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ
ＣＢｃｅｌｌｓ：ＣｈｉｃｋｅｎＢｌａｓｔｄｅｒｍａｌＣｅｌｌｓ
ＩＣＭ：ＩｎｎｅｒＣｅｌｌＭａｓｓ
ＰＧＣｓ：ＰｒｉｍｏｒｄｉａｌＧｅｒｍＣｅｌｌｓ
ＰＭＥＦ：ｐｒｉｍａｒｙｍｉｃｅｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ＰＣＥＦ：ｐｒｉｍａｒｙｃｈｉｃｋｅｎｅｍｂｒｙｏｎｉｃｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ
ＣＭ：ｃｏｎｄｉｔｉｏｎｍｅｄｉｕｍ
ＬＩＦ：ＬｅｕｋｅｍｉａＩｎｈｉｂｉｔｏｒｙＦａｃｔｏｒ
ＳＣＦ：ＳｔｅｍＣｅｌｌＦａｃｔｏｒ
ｂＦＧＦ：ｂａｓｉｃＦｉｂｒｏｂｌａｓｔＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ
ＡＫＰ：ＡｌｋａｌｉｎｅＰｈｏｓｐｈａｔａｓｅ
ＥＧＦ：ＥｐｉｄｅｒｍａｌＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ
高压灌注机ＩＧＦ．１：Ｉｎｓｕｌｉｎ．１ｉｋｅＧｒｏｗｔｈＦａｃｔｏｒ
ＤＭＥＭ：Ｄｕｌｂｅｃｃｌ’ｓＭｏｄｉｆｉｅｄＥａｇｌｅＭｅｄｉｕｍ
摘要
目前，世界各国争相研究胚胎干细胞并已取得了很大的进展，但是迄今为止仅在小鼠上获得真正意义上的Ｅｓ细胞，即具有参与生殖系传递能力的Ｅｓ细胞。本课题的目的是探索影响鸡Ｅｓ细胞生长的各种因素，从而建立适于鸡Ｅｓ细胞生长的培养体系并最终获得鸡Ｅｓ细胞。本实验采用饲养层培养法，以高糖ＤＭＥＭ添加Ｂ一巯基乙醇、胎牛血清、各种生长因子等为培养基，鸡的ｘ期胚盘为实验材料，分离筛选鸡ＥＳ细胞，并利用形态学鉴定、ＡＫＰ染、体外分化实验、嵌合体的制作等方法对所获得的细胞克隆进行鉴定。 『鸡ＥＳ细胞的生长受多种因素的作用，其中饲养层是影响鸡Ｅｓ细胞生长的关键因素之一。经反复实验对比鸡胚原代成纤维细胞饲养层、小鼠胚胎原代成纤维细胞饲养层、ＳＮＬ细胞饲养层等三种不同饲养层的作用效果，最终发现以小鼠原代成纤维细胞制作饲养层所获得的鸡Ｅｓ细胞阳性克隆率最高，在传代过程中Ｅｓ细胞的细胞成活率也明显高于其它两种饲养层细胞。
各种生长因子的添加也影响着鸡ＥＳ细胞的生长。ＬＩＦ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ等生长因子对Ｅｓ细胞的增殖生长具有不同的作用，其中ＳＣＦ、ｂＦＧＦ均不同程度的对ＥＳ细胞的生长有促进作用，但在无ＬＩＦ因子存在的条件下Ｅｓ细胞分化的现象比较明显。如加大ＬＩＦ因子的添加量（２０００１Ｕ／ｍ１），即使在无饲养层的条件下ＥＳ细胞也会维持不分化现象。并且发现ＬＩＦ、ＳＣＦ、ｂＦＧＦ三种生长因子按一定比例同时添加时ＥＳ细胞的ＡＫＰ阳性克隆率最高，与单独添加某～种生长因子的效果差异极显著。
在鸡的ｘ期胚盘细胞原代培养过程中，消化液可促进细胞的离散但细胞培养效果不如只用机械吹打的力量将胚盘分散，若克隆一旦形成，在传代过程中则需要消化液的作用并借助微针的剥离作用将克隆分散为小克隆或单细胞悬液（本实验所用的消化液为Ｏ．２５％胰蛋白酶＋０．０２％ＥＤＴＡ）。同时发现如将胚盘细胞明、暗区分开分别培养，结果由明区分离培养得到的Ｅｓ细胞阳性克隆率明显高于暗区及明十暗区，且克隆表面所附着的卵黄颗粒也比较少。将明暗区的胚盘细胞混合培养时所获得的Ｅｓ细胞阳性克隆率界于单独使用明、暗区之间。
鸡ｘ期胚盘细胞在饲养层上培养２４ｈ之后即会出现克隆，４８ｈ后克隆较明显，多呈圆形，其上附有卵黄颗粒（镜下呈黑颗粒），细胞间的间隙不明显。３～４天后克隆生长明显，隆起增大，多里鸟巢状，还有山包状，葵花状等。若细胞生长密集时两个克隆或更多个克隆连在一起呈多种型状。５～６天后克隆进一步生长增大，边缘更加清晰但同时也伴有少量的细胞分化，此时便需传代。离散后的细胞置于新的饲养层上２４ｈ后即可部分重新聚集增殖，但性状并不典型，４８～７２ｈ后会有集落出现，之后慢慢增大。将传至３、４代的鸡Ｅｓ细胞用三种冷冻方法分别进行冻存，一个月后快速解冻，以鸡Ｅｓ细胞的克隆数为细胞复苏存活标准，发现用冷冻程序１进行的慢速冷冻方法冷冻效果最好。
２
山东农业大学硕士研究生论文（２００２）
分离得到的鸡Ｅｓ细胞经ＡＫＰ染后呈深蓝紫，而饲养层细胞不着。在体外分化实验中，鸡Ｅｓ细胞在无饲养层无ＬＩＦ因子的培养液中培养时１～２天即可出现分化现象，３～４天可观察到几种细胞类型。最后用传至３代、４代的Ｅｓ细胞集落离散后制作嵌合体，得到了３只毛嵌合体鸡。
以卫结果表明用ＰＭＥＦ细胞饲养层，高糖ＤＭＥＭ为基础培养基，其中按一定比例添力口各种生长因子及ＦＢＳ等物质可将鸡胚盘细胞在体外进行长期培养，虽然还没有获得鸡Ｅｓ细胞系，但本实验
香肠和扇贝插在一起翻译英文
所获得的细胞具有Ｅｓ细胞的诸多特性，如果继续进行筛选、优化，必将能获得鸡Ｅｓ细胞系。
关键词：鸡；ｘ期胚盘细胞；饲养层；胚胎干细胞；生长因子；嵌合体
重钙粉生产设备安静：鸡胚胎干细胞的分离、培养及鉴定
１．引言
１．１胚胎干细胞的研究历史及现状
胚胎干细胞（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＳｔｅｍＣｅｌｌｓ，ＥＳ细胞）是由动物附植前胚胎的内细胞团
（ＩｎｎｅｒＣｅｌｌＭａｓｓ，ＩＣＭ）经体外分离培养而建立的克隆细胞系【ｌ】。ＥＳ细胞具有与胚胎细胞相似的形态特征及分化潜能，ＥＳ细胞能够在体外以胚胎细胞所特有的原始未分化方式进行无限生长并繁衍，在整个培养过程中都保持胚胎细胞的关键特性一一多潜能性，并且可在成年动物体内发育成所有类型的细胞ＨＩ，人们亦可对其进行遗传操作和选择。１９８１年英国的Ｅｖａｎｓ和Ｋａｕｆｍａｎ用延缓着床的胚泡首次成功的分离了小鼠胚胎干细胞，拉开了胚胎干细胞研究热潮的序幕ｐ１。之后，人们分别建立了猪（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ１９９０）、牛（Ｓａｔｉｏ１９９２）、绵羊（Ｐｉｅｄｒａｈｉｔａ１９９０，Ｔｉｌｌｍａｎｎ１９９６）、山羊（Ｍｅｉｎｅｅｋｅ－－－Ｔｉｌｌｍａｎｎ１９９１１９９２）、水貂（Ｓｕｋｏｙａｎ１９９２１９９３）、
兔（Ｑｒａｖｅｓ１９９３）”Ｊｌ“、及鸡（Ｐａｉｎ１９９６ｍＪ，Ｐａｒｋ２０００１７Ｊ）等动物的胚胎干细胞或类胚
胎干细胞系。
ＥＳ细胞的研究发展主要源于对小鼠畸胎瘤的研究。畸胎瘤是由小鼠性腺产生的，并由大量无序排列的体细胞构成，将小鼠胚胎肿瘤（Ｅｍｂｒｙｏｎｉｃ－ＣａｒｃｉｎｏｍａＣｅｌｌｓ，ＥＣ）细胞注射进入囊胚形成嵌合体后，ＥＣ细胞的发育能力显著增强，从而引出了干细胞的概念【ｇＪ，并且随着对干细胞的进一步研究，人们意识到将ＥＣ细胞作为哺乳动物发育模型具有极高的应用价值。１９８１年ＧａｉｌＭａｒｔｉｎ和ＭａｒｔｉｎＥｖａｎｓ［９１的研究工作证明畸胎瘤可以通过囊胚的异体移植获得，因此这些多潜能的细胞系可能直接来源于囊胚而不是肿瘤。
根据材料来源的不同，Ｅｓ细胞严格说应分为两类，一类为真正意义上的Ｅｓ
细胞，即从早期胚胎内细胞团（ＩＣＭ）中分离得到，另一类为胚胎生殖细胞
ＧｅｒｍＣｅｌｌｓ，ＰＧＣｓ）（ＥｍｂｒｙｏｎｉｃＧｅｒｍＣｅｌｌｓ．ＥＧ），是从胎儿原始生殖细胞（Ｐｒｉｍｏｒｄｉａｌ
中分离得到㈣。ＥＧ细胞与Ｅｓ细胞在生长形态，特性等方面极为相似，故人们习惯将其通称为Ｅｓ
dmm1
细胞。
禽类具有独特的胚胎发育过程和生殖生理特点，为其胚胎干细胞的分离培养及其遗传操作带来许多有利之处，但同时也存在许多缺陷。
皮尔斯电子
１．２鸡的生殖生理特点
鸡作为主要的家禽之一其世代周期短，约经６个月即可性成熟，较短时间即可选育建成优良鸡品种（系）。公鸡每３天采精一次可供十多只母鸡受精，容易获得大量转基因后代。另外鸡的生产性能高，每只母鸡平均年产蛋２５０枚，合成和分泌的蛋白在蛋内容易收集，可作为很好的生物反应器生产药用蛋白…】。与哺乳动物不同，鸡属于卵生，从囊胚期开始直到小鸡孵出无需在母体内，可在体外对鸡胚的发
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