一、T细胞的分离
1、抽20ml血到抗凝管内,或每1ml全血加入0.1ml(125-250)/ml肝素液摇匀,汇总到50ml离心管,加入20mlPBS(与全血等量)稀释。
2、提前在15ml离心管内加入3ml淋巴分离液。
3、用刻度吸管沿倾斜管壁,把稀释液缓慢叠加与分层液面,注意保持界面清楚。3ml全血+3mlPBS(已混匀)+3ml淋巴细胞分离液。
4、离心2000r,20min。
5、离心后取出离心管,可见管内液体有分层,抽取单个核细胞层至50ml离心管,加入5倍体积的PBS混匀。
6、2000r,10min离心。用PBS重悬,计数T细胞。1500r,10min,离心。用含血清的1640培养基重悬细胞为1×107/ml。
二、CD3+T的 筛选
a、将小管内的免疫磁珠摇匀悬浮(漩涡〉30s,或倾斜旋转5min)。 b、取出所需量的免疫磁珠到1.5ml试管内,单个核细胞总数为1×107/ml,每毫升中适宜磁珠数量为2.5×107个。 c、加入1ml含血清的1640并混悬好,漩涡钽酸锂晶体〉30s,或保持滚动至少5min。
d、将试管放入磁体架内1min,吸管吸弃上清。
f、试管离开磁体,用与初始免疫磁珠体积等量体积的培养液重悬磁珠。
B、分离
a、将混悬好的免疫磁珠试管放在磁性细胞分离架上,吸取上清,加入单个核细胞悬液,拿起试管,离开磁场,轻轻混悬几秒钟。
b、将免疫磁珠和样本放在4°C冰箱孵育20min,倾斜旋转。
c、将试管放在细胞分离架上分离2min,
d、待磁珠结合细胞到达试管壁后用吸管轻轻吸取上清。
f、试管离开磁体,加入1ml含血清的1640,轻轻混合,洗涤,尽量使磁珠脱离细胞的丢失减少到最低。
g、将试管放在磁体上2min,用吸管吸弃上清。
h、重复f-g清洗2次。
i、洗完后,加含血清的1640到筛选的CD3阳性细胞中,混悬。计数。
三、CD3阳性细胞的激活和扩增
钢水净化剂 A、CD3/CD28beads的洗涤
步骤同二A
B、T细胞的激活
a、6孔板 5×105/ml,2ml培养液。
b、加入已洗好的beads,使beads:细胞=1:1.
防盗 c、放入培养箱培养3天。
C、扩增背心袋
a、3天内培养液不需要更换,第3天时加30U/mlIL-2,同时换培养基,细胞在48h后数量会增殖到2倍,但不允许超过 2×106/ml 。
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b、放入培养箱培养。
c、每天观察细胞,记录细胞的大小和形状,在细胞液变黄时可看到细胞萎缩和细胞增殖率。
蚕蛹虫草 d、细胞隔一天计数。
e、4-5天刺激后可移去beads,上下移动细胞5-10次,避免有气泡和湍流,这个可以使细胞和beads分离。收集细胞到1.5ml管内,放到磁体上1min至beads到管壁上。把细胞移到另外的管内。分离beads前后各计数一次。