一、目的要求空心砌块
了解细胞分离与细胞悬浮培养的全过程，学会整个细胞培养程序的实验方法和操作技术。
二、材料、仪器与试剂
车灯透镜1、材料：水稻种子；
2、仪器：超净工作台、带相机设备及相同设备个光学显微镜、可变速离心机、玻璃过滤器、血细胞计数器、目镜及物镜测微尺、计数器、酸度计； 3、试剂：
（1）培养基（MS、B5、N6）
筛板塔（2）植物激素（2，4-D、NAA、KT）、二醋酸荧光素、酚藏红花或伊文思蓝等燃料。
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三、方法步骤
（1）外植体的表面消毒挑选籽粒饱满的水稻种子，人工去掉谷壳，用70%酒精表面消毒2min，然后用2.5%次氯酸钠水溶液浸泡30min，期间用玻璃棒搅动，无菌水冲洗3次。
（2）接种培养基表面将消毒后的种子按每瓶3粒接种于琼脂培养基表面，置于暗条件下培养。
（3）切割愈伤组织3周后将形成的愈伤组织切割，并转移继代培养。
（4）疏松愈伤组织诱导形成的愈伤组织，其质地和物理性状有明显的差异，有的很坚实，有的很松散，需进行继代筛选。同时应考虑基本培养基中铵态氮与硝态氮的比例培养基中激素的含量及不同激素的比例，以及某些天然有机附加物对愈伤组织生长和形态的影响。培养基中加入酵母提取物（3~5g/L），将获得生长好、质地疏松的愈伤组织。
（5）愈伤组织继代培养由于愈伤组织的生理状态将直接影响以后的细胞悬浮培养，故应及时挑选幼嫩的部分接种转移。一般继代培养的间隔以2周为宜。
2、单细胞的分离
（1）愈伤组织细胞的计数用于分离单细胞的愈伤组织每克鲜重含若干细胞，可预先计数。称取1g幼嫩新鲜的愈伤组织，加入0.1%果胶酶（用培养液或0.6mol甘露醇作溶剂。配制后，用200g离心5min，取上清液，调节pH值为3.5），放在25℃的培养室中12~16h，再用电磁拖泥带水搅拌器低速搅
动3min即可获得细胞悬浮液，然后用细胞计数板技术。
（2）单细胞的分离参照所测得的愈伤组织细胞数，称取适量的愈伤组织，放入含适量液体培养基的125mL三角瓶，置于110r/min旋转式摇床上振荡，暗培养，室温25~28℃。（3）悬浮液的过滤连续振荡3周后，用148μm尼龙网过滤，以除去愈伤组织碎片及较大的细胞聚集体。经过滤后，可获得95%左右的单个游离细胞。
单细胞的收集。过滤液用200g离心5min，收集单个细胞及小的聚集体。
3、细胞悬浮培养
（1）计算细胞起始密度离心后将约2/3的上清液倒掉，剩下的1/3的大部分移入一预先消毒的125mL三角瓶中待用。离心管中最后剩余1mL上清液，摇动离心管，使沉淀悬浮。吸取1滴于血细胞计数板上，以游离单细胞为基数计算细胞的密度。
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细胞计数方法：以上海医用光学仪器厂生产的血细胞计为例，吸取1小滴细胞悬浮液滴于记数板上，将盖玻片轻轻由一边向另一边盖下，轻压盖玻片使之与计数板完全密合，以
免产生气泡影响计数。计数的原理详见产品说明书。计数时在显微镜视野中计数5个中方格中的细胞数。这5个中方格指位于四个角与中央的中方格。每个样品重复计数5次，求其平均值。计算公式简化
如下：
细胞数/ml=5个中方格的细胞数×50×1000
（2）测定活细胞率在医用血细胞计数器计算细胞密度的同时，用酚藏红花溶液和二醋酸酯荧光素溶液测定活细胞率。水稻种子的活细胞率可达50%左右。
活细胞率的测定方法：先配制0.1%酚藏红花水溶液，溶剂为培养液。二醋酸酯荧光素则先用丙酮配成每毫升含5mg二醋酸酯荧光素的母液，储藏在冰箱中备用。使用时，用培养液稀释母液成0.01%的浓度。
先将培养物和二醋酸酯荧光素溶液在载玻片上与上述溶液混合。酚藏红花能使死细胞染上红，在染料与细胞悬浮培养物混合后，很快就可以在普通显微镜下观察。活细胞不被酚藏红花染，即使30min后也是如此。
（3）细胞悬浮液培养将上述（1）项中剩余的近1/3的上清夜倒入离心管中，并根据需要的起始刻度，补充加入新鲜的培养基。接种的三角瓶置于110r/min 的旋转式摇床上连续振荡培养，在室温（29±1）℃暗条件下培养，培养期间对悬浮培养的细胞定期计数细胞密度。（4）细胞团和愈伤组织的再形成悬浮培养的单个细胞在3-5d内即见细胞分裂。经过一周左右的培养，单个细胞和小的聚集体不断分裂形成肉眼可见的小细胞团。
（5）植株的再生大约培养2周后，将细胞分裂形成的小愈伤组织团块（直径0.5-2.5mm）及时转移到分化培养基上，连续光照，室温（25±1）℃。3周左右后即可分化出试管苗。待试管苗长至试管顶端时（大约在愈伤组织转至分化培养基后40d），取出洗掉琼脂，将根在0.1%烟酰胺水溶液中浸泡1h，然后移栽于塑料钵中，放入可照光和通入蒸汽的塑料罩中1周，再移入玻璃温室中。
四、实验报告
绘出细胞悬浮培养操作程序图，你认为其中哪些步骤可以改进，如何改进，请提出你的建议。
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