马琳1，刘芙蓉1，张淑兰2
净化水体
1 中国医科大学附属第二临床学院妇产科，沈阳（110013）
2 中国医科大学卫生部细胞生物学重点实验室，沈阳（110013）
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摘要：目的 探讨循环肿瘤DNA中RASSF1A基因的甲基化及其与卵巢癌的关系。方法应用甲基化特异性PCR (MSP)方法，对51名正常健康人、51例卵巢癌患者和51例卵巢良性肿瘤患者循环DNA RASSF1A基因的甲基化进行了检测。结果 51名正常健康人和51例卵巢良性肿瘤患者循环DNA RASSF1A基因甲基化的发生率均为0; 51例卵巢癌患者循环肿瘤DNA RASSF1A甲基化的发生率为43.1% ( 22 /51, P < 0.05) 。RASSF1A 甲基化与卵巢癌组织学类型无明显相关性( P > 0.05) 。临床Ⅰ期和Ⅱ期循环肿瘤DNA RASSF1A基因甲基化的发生率明显低于临床Ⅲ期和Ⅳ期(P<0.05) ；高和中分化组RASSF1A 基因甲基化的发生率低于低分化组(P<0.05) 。结论 RASSF1A基因甲基化在卵巢癌的发生和发展过程中起重要作用。卵巢癌患者的循环肿瘤DNA中可以检测到RASSF1A 基因的甲基化，与卵巢癌的临床分期和组织学分级有关。循环肿瘤DNA 中RASSF1A甲基化的检测有助于卵巢癌的诊断和预后判定。
关键词：卵巢肿瘤；DNA甲基化；RASSF1A基因；抑制，肿瘤
卵巢癌在妇科肿瘤中死亡率高居首位，主要原因是其发病隐匿，不易早期诊断。循环肿瘤DNA概念的提出，为检测卵巢癌患者血液中肿瘤相关基因的改变开辟了新的途径。我们应用甲基化特异性PCR (methylation－specific PCR, MSP) 方法，检测卵巢癌患者血液中循环肿瘤DNA RASSF1A基因的甲基化，目的在于探讨循环肿瘤DNA RASSF1A基因甲基化在卵巢癌诊断和预后中的作用。
1. 材料与方法
１、标本来源: 51例卵巢癌和51例卵巢良性肿瘤患者的血液标本分别取自2000—2003年在中国医科大学附属第二医院住院患者，标本均于手术前采集, 51 例正常血液标本取自健康人。血液样本采集后立即离心, 10 min后保留上清液1 ml, - 30℃保存。所有卵巢癌病例术前均未经放疗和化疗。其中卵巢癌包括：浆液性囊腺癌25例，黏液性囊腺癌11 例，内膜样癌10 例，恶性畸胎瘤5 例; Ⅰ期11例, Ⅱ期10例, Ⅲ期24例, Ⅳ期6例；高分化19例，中分化12例，低分化20例。卵巢良性肿瘤包括：浆液性囊腺瘤27例，黏液性囊腺瘤13例, 成熟畸胎瘤
11例。所有病例均经病理确诊。
2、DNA提取：血清DNA应用Qiagen Column纯化，按照Qiagen公司QIAamp BloodMini Kit 试剂盒说明进行。紫外分光光度计测定DNA含量。
3、甲基化特异性PCR (MSP) : 首先应用hydroquinone和NaHSO3 (Sigma公司)对DNA进行甲基化处理, 然后PCR扩增(Takara公司)。RASSF1A甲基化引物, 上游: 5′－GGGTTTTGCGAGAGCGCG－3′; 下游: 5′－GCTAACAAACGCGAACCG－3′。RASSF1A 非甲基化引物, 上游: 5′－GGTTTTGTGAGAGTGTGTTTAG－3′; 下游: 5′－CACTAACAAACACAAACCAAAC－3′(上海基康公司) 。10µl反应体系中: 10×PCR buffer
1本文得到国家自然科学基金资助项目( 30100104) ; 2004年教育部高等学校博士学科点专项科研基金资助课题(20040159019)的资助。
1µl, 2.5 mmol /L dNTP 0.8µl, 引物分别为1µl，甲基化处理.后DNA 1µl, Taq酶0.05µl, H2O
℃℃℃共40个循环, 最后72℃5.2µl。反应条件: 95℃预变性15 min, 94 30 s, 64 50 s, 72 30 s
延伸5 min。以经过甲基化酶SssⅠ处理过的DNA 作为甲基化的阳性对照。取PCR产物5µl 进行2%琼脂糖凝胶电泳(含溴化乙锭0.5 mg/ml)检测, Kodak Digital Science 凝胶成像系统照相。
4、统计学处理：采用χ2 检验。
2. 结果
1、循环肿瘤DNA RASSF1A基因的甲基化: 51 名正常健康人血液DNA中均未见RASSF1A 基因甲基化，甲基化的发生率为0; 51例卵巢癌患者循环肿瘤DNA RASSF1A 甲基化的发生率为43.1% ( 22 / 51) ; 51例卵巢良性肿瘤患者RASSF1A 基因甲基化的发生率为0。卵巢癌患者循环肿瘤DNA RASSF1A甲基化与卵巢良性肿瘤患者和正常健康人相比，差异有统计学意义( P < 0.05) 。
2、循环肿瘤DNA RASSF1A基因甲基化与卵巢癌临床病理特征之间的关系: 循环肿瘤DNARASSF1A基因甲基化在浆液性癌、黏液性癌、内膜样癌和恶性畸胎瘤各组间比较差异均无统计学意义( P > 0.05) 。临床Ⅰ期和Ⅱ期RASSF1A基因甲基化的发生率( 23.8%, 5 /21)低于临床Ⅲ期和Ⅳ期(56.7% , 17 /30) ，差异有统计学意义( P < 0.05) 。高、中分化组RASSF1A 基因甲基化的发生率(29.0% , 9 /31)低于低分化组(65.0%, 13 /20) ，差异有统计学意义( P < 0.05) 。见表1和图1。
3. 讨论
卵巢恶性肿瘤由于早期缺乏明显的自觉症状而不易被发现，多数患者就诊时已进入晚期, 5 年存活率很低，所以及时有效的诊断手段对卵巢癌及预后判定十分重要。以往对卵巢癌基因水平的研究均局限于肿瘤原发组织，而癌组织的获取一般均来源于手术后切除的标本，很难在患者进行手术前检测到某些基因的改变。因此，如果能够在手术前发现肿瘤重要相关基因的改变，对卵巢癌的诊断特别是对高危人的筛查将有重要的临床应用价值。循环肿瘤DNA可能来源于坏死或凋亡的肿瘤细胞进入血液
循环释放出的游离DNA或生长活跃的肿瘤细胞脱离原病灶侵入血液循环[ 1－3 ] 。目前循环肿瘤DNA 已经用于检测乳腺癌、结肠癌、肺癌和头颈癌血液、痰液和分泌物中某些肿瘤标记物的改变如微卫星不稳定、杂合性缺失、基因突变和甲基化等[ 4－6 ]。Dammann等[ 7 ]于2000 年首次发现并报道RASSF1基因并获得了RASSF1基因的cDNA克隆, 通过选择不同的启动子和应用不同的mRNA 剪接方式, RASSF1基因表达可以得到3 个不同的转录本: RASSF1A、RASSF1B和RASSF1C。RASSF1基因可能与乳腺癌、卵巢癌、鼻咽癌、肾癌、膀胱癌和胃癌等多种常见肿瘤密切相关。我们认为，基因的甲基化是导致基因转录失活的主要机制, RASSF1A 作为一种抑癌基因，在多种肿瘤中该基因表达缺失，除基因的缺失和突变外, 5′端启动子区CpG岛的异常甲基化被认为是导致该基因异常的重要原因之一, RASSF1A启动子区的甲基化导致了该基因的表达缺失，因而促进了多种肿瘤的发生和发展。Dammann等[ 7, 8 ]对肺癌和乳腺癌的研究证实RASSF1A 基因在肿瘤细胞或肿瘤组织中都有mRNA表达的缺失，但我们认为RASSF1A作为抑癌基因，其mRNA表达缺失的原因可能是基因启动子区的异常甲基化，而非基因突变所致。Dulaimi 等[ 9 ]的研究发现, RASSF1A基因的甲基化不仅存在于乳腺癌组织中(22 /34) ，在乳腺癌循环肿瘤DNA中也有19例发生了RASSF1A的甲基化，因此Dulaimi提出如果应用血液循环肿瘤
DNA 来检测包括RASSF1A在内的多个肿瘤相关基因及其甲基化将有助于提高对乳腺癌的早期发现。我们应用MSP方法对51例卵巢癌、51例卵巢良性肿瘤患者以及51 名正常健康人血液DNA 的RASSF1
A基因甲基化状态进行了研究。结果发现,RASSF1A基因的甲基化只在卵巢癌患者的循环肿瘤DNA中存在，发生率为4311% ，而在51例卵巢良性肿瘤患者和51名正常健康人循环肿瘤DNA中均无RASSF1A 基因甲基化发生, 该结果表明, RASSF1A 可能是卵巢癌发生的重要相关抑癌基因, 其启动子区的甲基化使基因表达失活，导致了卵巢癌的发生，并且应用循环肿瘤DNA可以检测到这一分子改变。我们还发现, 循环肿瘤DNA 的RASSF1A甲基化与卵巢癌的组织学类型无明显的相关性，表明RASSF1A基因的甲基化参与了多种类型的卵巢癌的发生。RASSF1A甲基化的发生在临床Ⅰ期和Ⅱ期明显低于临床Ⅲ期和Ⅳ期，差异有统计学意义( P < 0.05) ; 在高分化组和中分化组也明显低于低分化组，差异有统计学意义( P < 0.05 ) 。该结果表明, RASSF1A基因的甲基化与卵巢癌的临床分期和细胞分化程度密切相关，随着卵巢癌病程的进展和恶化, RASSF1A 基因的甲基化明显增多。在本研究中, 23.8% (5 /21)临床Ⅰ、Ⅱ期卵巢癌患者的循环肿瘤DNA有RASSF1A基因的甲基化, 提示RASSF1A基因甲基化可能是卵巢癌发生的早期分子遗传学改变, 随着卵巢癌病程的进展, 这种分子改变将持续存在。循环肿瘤DNA提供了通过血液检测卵巢癌分子遗传学改变的方法, 通过收集血液标本，检测循环肿瘤DNA的RASSF1A甲基化，有助于卵巢癌患者的术前诊断, 特别是联合应用多种肿瘤相关基因对高危人的筛查，将更有助于早期发现卵巢癌患者，从而早期，提高预后。
参考文献
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Expression of circulating hypermethylated tumor－specific RASSF1A DNA in ovarian cancer pa tients
Ma Lin，Liu Furong，Zhang Shulan
Department of Obstetric and Gynecology，The Second Affiliated Hospital，China Medical
University，Shenyang （110004）
Abstract
Objective To detect hypermethylated tumor－specific RASSF1A DNA in the circulation and its significance in ovarian cancers patients. Methods Methylation－specific polymerase chain reaction (MSP) was used to study the hypermethylation of RASSF1A in p reoperative serum samp les from 51 ovarian cancer patients. Results The RASSF1A gene was not methylated in peripheral blood samp les from 51 normal patients and 51 patientswith benign ovarian tumors. Hypermethylation of RASSF1A gene was found in circulating tumor－specific DNA in 43. 1% of patients ( 22 out of 51 cases) with ovarian cancers ( P < 0.05). There was no difference in hypermethylation of RASSF1A gene amongst various ovarian cancer subtypes ( P < 0. 05 ). On the other hand, hypermethylation of RASSF1A gene
半夏去皮机ⅢⅣⅠⅡ
wasmore frequently encountered in stage and than stage and tumors ( P < 0. 05). It was rarely seen in well and moderately differentiated groups, as compared with poorly differentiated group (P<0.05 ). Conclusions There is a higher frequency of RASSF1A hypermethylation in circulating tumor －specific DNA of ovarian cancer patients. RASSF1A has been postulated to play an important role as tumor suppressor gene and can be silenced by promoter hypermethylation. Thismethylation correlateswith clinical stage and histopathologic grade. Such observation may carry
diagnostic and prognostic imp lications when assessing ovarian tumors.
Keywords：Ovarian neoplasma；DNA methylation；RASSF1A genes；suppressor；tumor
表1循环肿瘤DNA RASSF1A基因甲基化与卵巢恶性肿瘤临床病理特征之间的关系
类别例数
阳性例数阳性率(% ) P值
病理类型
浆液性癌 25 11 44.
黏液性癌 11 5 45.
5
内膜样癌 10 4 40.
恶性畸胎瘤 5 2 40. 0 > 0. 05 临床分期
Ⅰ、Ⅱ期 21 5 23.
加密存储8
Ⅲ、Ⅳ期30 17 56. 7 < 0. 05 病理分级
高分化 19 5 26.
3 中分化 12
电动车贴花4 33.
3 低分化20 13 65. 0 < 0. 05
U为非甲基化;M为甲基化;M +为甲基化的阳性对照;Marker为相对分子质量标记
图1RASSF1A基因甲基化和非甲基化
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