超音频电源长链非编码RNA Peg13在七氟烷所致的发育期原代神经元凋亡中的作用 蒋云凤;程燕咏;孙宇
移动终端安全【摘 要】目的 ·研究长链非编码RNA (long non-coding RNA,lncRNA) Peg13 (paternally expressed 13)在七氟烷所致的发育期原代神经元凋亡中的作用.方法 ·以胎龄为14.5 d的小鼠胎鼠的原代神经元为研究对象,实时定量PCR检测七氟烷处理不同时间后lncRNAPeg13的表达水平.荧光原位杂交实验检测lncRNA Peg13在原代神经元中的定位.构建lncRNA Peg13过表达和敲减质粒,分别转染原代神经元.4.1％的七氟烷处理6h后,荧光显微镜观察原代神经元的形态改变;采用CCK-8分析原代神经元的活力;采用TUNEL、Western blotting检测原代神经元的凋亡程度.结果 ·在七氟烷处理的原代神经元中,lncRNA Peg13的表达水平呈时间依赖性下降.LncRNA Peg13在原代神经元的细胞质和轴突中广泛表达.过表达lncRNA Peg13可明显缓解七氟烷处理所致的神经元形态改变,导致神经元活力提高,凋亡细胞比例减少,Bcl-2、Bax蛋白表达量的比值(Bcl-2/Bax)升高,caspase-3的表达水平降低.敲减lncRNAPeg13可明显加剧七氟烷处理所致的神经元形态改变,导致神经元活力降低,凋亡细胞比例增加,Bcl-2/Bax降低,caspase-3的表达水平升高.结论 ·LncRNAPeg13能够缓解七氟烷诱导的发育期原代神经元的凋亡. 【期刊名称】《上海交通大学学报（医学版）》
【年(卷),期】2019(039)005
【总页数】9页(P469-477)
【关键词】七氟烷;长链非编码RNA Peg13;发育期原代神经元;细胞活性;细胞凋亡
【作 者】蒋云凤;程燕咏;孙宇
工位管理系统
【作者单位】上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科,上海200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科,上海200011;上海交通大学医学院附属第九人民医院麻醉科,上海200011
【正文语种】中 文
【中图分类】R614
七氟烷是临床产科和小儿麻醉中较常用的吸入麻醉药[1]。然而，七氟烷暴露可引起严重的
神经系统不良反应，如认知障碍、行为异常以及类似自闭症谱系障碍的症状。临床研究[2-4]表明，早期长时间或反复的麻醉暴露会增加儿童日后出现学习障碍、发育障碍和行为障碍的风险。动物实验研究[5-7]显示，七氟烷暴露容易导致灵长类动物和啮齿类动物认知功能障碍。此外，尽管七氟烷能够诱导发育期大脑发生广泛的细胞凋亡和病理改变，但其潜在的神经毒性机制尚不完全清楚[8]。防爆鼠标
越来越多的研究[9-12]表明，长链非编码RNA（long noncoding RNA，lncRNA）不仅参与调控神经系统的多种生物学过程（包括神经发育、可塑性、分化和凋亡），还在多种神经系统疾病（如阿尔茨海默病、自闭症谱系障碍、神经性疼痛）中异常表达。研究[13-14]显示，七氟烷处理可改变脑内多种lncRNA的表达水平。本课题组前期研究采用RNA测序获得小鼠发育期原代神经元在七氟烷暴露前后的lncRNA差异表达谱，并通过实时定量PCR证实在七氟烷暴露后原代神经元中lncRNA Peg13（paternally expressed 13）的表达量显著下调；因此推测lncRNA Peg13可能在七氟烷诱导的神经损伤中发挥作用。
本研究通过在小鼠神经元中过表达和敲减lncRNA Peg13来探索lncRNA Peg13在七氟烷暴露所致的神经系统损伤中的作用及机制。
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1 材料与方法
1.1 实验材料
1.1.1 实验动物 胎龄为14.5 d的清洁级C57小鼠（共4只）购自上海西普尔-必凯实验动物有限公司。实验动物生产许可证号为SCXK（沪）2018-0006。本实验符合上海交通大学医学院附属第九人民医院实验动物伦理操作规范。实验动物使用许可证号为SYXK（沪）2016-0016。
1.1.2 主要试剂和仪器 Neurobasal培养基、DMEM 培养基、胎牛血清、B27 无血清补充剂、多聚赖氨酸、0.25%胰酶、双抗（GIBCO，美国），原位杂交试剂盒（BOSTER，美国），CCK-8试剂盒、TUNEL试剂盒（上海翊圣生物科技有限公司），Bcl-2、Bax、caspase-3抗体、β-actin抗体（Cell Signaling Technology，美国），电穿孔转染试剂、电泳液 （上海生工生物工程有限公司），TRIzol （Invitrogen，美国），PrimeScript 反转录试剂盒（TaKaRa，日本），BCA 蛋白定量试剂盒（上海威奥生物科技有限公司）。lncRNA Peg13敲减载体和过表达载体（上海吉满生物科技有限公司）。
超净工作台、细胞培养箱（Thermo Fisher，美国），多功能酶标仪（Bio Tek，美国），倒置相差显微镜（Nikon，日本），QuantStudio实时荧光定量 PCR 仪（ABI，美国），激光共聚焦显微镜（Leica，德国），电泳仪（Bio-Rad，美国），超敏化学发光成像系统（GE，美国）。
1.2 细胞培养
1.2.1 原代神经元分离培养 将胎龄为14.5 d的 C57小鼠处死，取出胚胎，用75%乙醇浸泡消毒。用精细镊子取出脑组织，加入0.25%的胰酶在培养箱中消化18 min。移除管中多余的消化液，加入10 mL含10%胎牛血清的DMEM培养基终止消化。将上清液置于离心机中以600×g离心5 min后，用含10%胎牛血清的Neurobasal接种培养基重悬。以3×106 个/mL的密度接种于多聚赖氨酸（50 μg/mL）包被的培养板中，置于37℃培养箱中培养。4 h后将接种培养基换成含2% B27的Neurobasal维持培养基继续培养。使用倒置相差显微镜观察原代神经元的生长情况。
1.2.2 细胞转染 实验分为lncRNA Peg13过表达组、过表达对照组、lncRNA Peg13敲减组、敲减对照组。设计3条lncRNA Peg13 RNA干扰序列（表1）。
表1 靶向LncRNA Peg13的RNA干扰序列Tab 1 RNA interference sequences targeting lncRNA Peg13名称 RNA 干扰序列（5′→ 3′）对照 TTCTCCGAACGTGTCACGT序列1 GCCTGTACAGCTCTTTGTTAT序列2 GCAGCACTGGGTTATGATAAC序列3 GGTGTTTAGCCTTCCTCTTTG
将上述“1.2.1原代神经元分离培养”步骤中获得的原代神经元细胞悬液，用接种培养基稀释成3×106个/mL。吹匀细胞悬液，吸取1 mL 置于1.5 mL EP 管中，在常温下以600×g 离心7 min。吸除上清液，加入100 μL 电穿孔转染试剂重悬，加入3 μg 质粒，混匀。以“Neurons Mouse”模式使用电穿孔转染仪进行转染。将电穿孔转染后的细胞悬液吸至EP 管中，并补齐相应体积的接种培养基，接种至六孔培养板。第3日加入0.15 μg/mL的嘌呤霉素筛选，第5日半量换液，第7日提取RNA验证质粒转染效果。
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1.3 七氟烷处理原代神经元
原代神经元于贴壁后第7日进行七氟烷处理。根据是否接受七氟烷处理将细胞分为：①空白组，不做任何处理。②七氟烷组，使细胞在4.1%的七氟烷中分别暴露2、4、6 h，在每个时间点取样检测。根据是否接受七氟烷处理以及是否改变lncRNA Peg13的表达情况，将细
胞分为：①过表达对照组。②过表达对照+七氟烷组。③lncRNA Peg13过表达组。④lncRNA Peg13过表达+七氟烷组。⑤敲减对照组。⑥敲减对照+七氟烷组。⑦lncRNA Peg13敲减组。⑧lncRNA Peg13敲减+七氟烷组。细胞在4.1%的七氟烷中暴露6 h后，取样本检测。
1.4 RNA提取及定量
按照说明书用TRIzol提取原代神经元总RNA。使用PrimeScript反转录试剂将RNA反转录为cDNA。反转录条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s。以cDNA为模板，使用标准的SYBR-Green法进行PCR，评估每个目标基因的表达水平。PCR扩增条件：预变性95 ℃ 30 s；变性95 ℃ 5 s，退火60 ℃ 30 s，延伸72 ℃ 30 s，重复40个循环。以Gapdh为内参基因，引物序列见表2。采用2-ΔΔC t法表示目标基因的相对表达水平。
表2 实时定量PCR引物序列Tab 2 Sequences of primers for real-time PCR基因 引物（5′→ 3′）lnc RNA Peg13正向引物 CTCACTTTGGTTTGAATGGGAT反向引物 AAGACGATTAGATTGGGTTGC Gapdh正向引物 AATGGATTTGGACGCATTGGT反向引物 TTTGCACTGGTACGTGTTGAT
1.5 CCK-8检测细胞活力
将电穿孔转染后的原代神经元以密度为2×104/100 μL接种于多聚赖氨酸（50 μg/mL）包被的96孔板中。培养第7日时，用4.1%的七氟烷处理细胞6 h。弃去原有培养基，每孔加入100 μL新鲜培养基和10 μL CCK-8溶液，混匀后置于培养箱中继续培养4 h。在酶标仪上于450 nm波长处检测吸光度值。
1.6 TUNEL染检测细胞凋亡
原代神经元在多聚赖氨酸处理的盖玻片上培养。用4.1%的七氟烷处理细胞6 h，将盖玻片放在4%多聚甲醛中固定25 min，再置于通透液中（0.2% Triton X-100）5 min。每张盖玻片加50 μL TUNEL反应液，37℃避光孵育60 min，磷酸盐缓冲液（phosphate buffer saline，PBS）洗3遍，每次5 min。用抗荧光衰减封片剂封片后，荧光显微镜下观察。
1.7 原位杂交
原代神经元在多聚赖氨酸处理的盖玻片上进行培养。细胞培养第4日，0.1 mol/L PBS（pH 7.4）洗3次，每次2 min。4%多聚甲醛（用0.1 mol/L PBS配制，含0.1% 焦碳酸二乙酯）。
室温固定20～30 min。滴加新鲜配制的以3%柠檬酸稀释的胃蛋白酶，37 ℃消化60 s。0.5 mol/L PBS洗3次，每次5 min。蒸馏水洗1次，每张盖玻片加20 μL预杂交液，置于42 ℃恒温箱4 h。用杂交液稀释标记的寡核苷酸探针（正义链AAGACGATTAGCTTGGGTTGC，反义链CTCACTTTG GTTTGAATGGGAT），浓度 1 μg/mL。每张切片加 20 μL杂交液，恒温箱42 ℃杂交过夜（12～16 h）。滴加封闭液37 ℃孵育30 min，滴加生物素化鼠抗（1:100）37 ℃孵育60 min。0.5 mol/L PBS洗4次，每次5 min。取10 μL链霉亲和素-生物素化过氧化物酶复合物（strept avidin biotin-peroxidase complex，SABC） -CY3， 加原位杂交用的PBS 990 μL混合。每张切片加50 μL样品，37 ℃孵育 30 min。0.5 mol/L PBS洗3次，每次5 min。用抗荧光衰减封片剂封片后，激光共聚焦显微镜观察。
1.8 Western blotting检测细胞凋亡
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