乌头赤石脂丸方对急性心肌梗死大鼠血清炎症因子及
心肌CX43蛋白表达的影响
谢璐璐郭军鹏张兆鹏连春雨肖钰雪史晓梅王松刘宏岩
（长春中医药大学，吉林长春130117）
〔摘要〕目的通过观察乌头赤石脂丸方对急性心肌梗死（AMI）大鼠血清炎性因子及心肌缝隙连接蛋白（CX）43蛋白表达的影响，探究乌头赤石脂丸方干预AMI大鼠的作用机制。方法雄性大鼠36只，随机分成正常组、模型组、乌头赤石脂丸方低中高剂量组、尿激酶组。除正常组以外，其余各组均采用结扎冠状动脉左前降支的方法复制AMI模型，以心电图ST 段弓背型抬高为造模成功的标志，于造模成功的第2天开始灌胃给药，连续灌胃7d后取材。观察大鼠心肌缺血前后心电图的改变；检测大鼠凝血4项指标凝血酶原时间（PT）、活化部分凝血活酶时间（APTT）、凝血酶时间（TT）、纤维蛋白原（Fbg）的变化；酶联免疫吸附试验检测大鼠血清中C反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）$、脑钠肽（BNP）；苏木素-伊红（HE）染观察心肌形态学的变化；免疫组织化学法观测心肌组织中CX43蛋白表达情况。结果与正常组比较，模型组心电图ST段显著弓背型抬高,PT、APTT、TT、Fbg增加；与模型
组相比较，各组心电图ST段不同程度降低并岀现病理性Q波；乌头赤石脂丸方低、中、高剂量组CRP、IL-6、BNP均降低（P<0.01,P<0.05）；乌头赤石脂丸高剂量组PT、TT时间降低（P<0.05,P< 0.01），乌头赤石脂丸低、中、高剂量APTT时间降低（P<0.01）,Fbg含量减少（P<0.01）；HE染显示，与正常组相比较，模型组心肌纤维扭曲断裂，肌丝排列紊乱，细胞着不均匀，部分细胞核固缩，心肌细胞间有炎细胞浸润；与模型组相比较，组心肌纤维不同程度地恢复，心肌细胞有少量炎细胞；免疫荧光显示，与正常组相比较，模型组CX43蛋白表达量减少，分布不均匀；与模型组相比较，组CX43蛋白表达量不同程度增加，分布均匀。结论乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心肌炎症有一定的改善作用，其机制可能与降低血清炎性因子CRP、IL-6等含量有密切关系。
〔关键词〕乌头赤石脂汤；急性心肌梗死；炎症因子；缝隙连接蛋白43
〔中图分类号〕R285.5〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2021）08-1691-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2021.08.038
急性心肌梗死（AMI）是由于冠状动脉血流急性受阻、中断导致相应的心肌严重缺血坏死，临床症状危急，死亡率较高，容易引起心力衰竭。据《2018年中国心血管病报告》显示〔JAMI死亡率总体呈上升态势，已经成为我国重大的公共卫生问题。近年来中医药在冠心病的防治上取得了良好的效果，但对AMI的防治还缺乏更加有效、方便、快捷的办法。
中华中医药学会《胸痹心痛中医诊疗指南》中明确指出胸痹心痛相当于西医的冠心病心绞痛〔2〕。课题组前期实验已证实乌头赤石脂丸方可改善心肌缺血损伤的程度，减少心肌细胞的凋亡，并可改善心肌缺血再灌注造成的心肌损伤〔3~5〕。基于课题组已研究的成果，本实验旨在进一步探讨乌头赤石脂丸方对AMI大鼠心功能的保护作用及AMI与炎症反应的关系。
基金项目：吉林省科技厅资助项目（20170101007JC）
通信作者：刘宏岩（1957-），男，教授，博士生导师，从事中医临床基础研究。
第一作者：谢璐璐（1992-），女，硕士在读，主要从事中医临床基础研究。1材料与方法
1.1动物SPF级SD雄性大鼠，体重（260±20）g，购自长春亿斯实验动物技术有限公司，本实验通过长春中医药大学实验动物伦理委员会审查批准。1.2药物乌头赤石脂丸方依据张仲景《金匮要略•胸痹心痛短气病脉证治第九》中原方原比例而定，乌头选用川乌。方中蜀椒、川乌、干姜、附子、赤石脂比例为2：1：1：1：2，中药饮片均购自长春中医药大学附属医院中药饮片房。本实验在不改变药物量效比例的前提下，易丸为汤，根据人服用药量换算成大鼠给药量，大鼠日用量为：蜀椒1.26g、乌头0.63g、附子0.63g汗姜0.63g、赤石脂1.26g，中剂量为临床等效剂量，低、高剂量分别按中剂量1/3、3倍比例换算可得。煎煮方法：将川乌放入10倍体积水中浸泡30min，煎30min，再与附子同煎60min后放入蜀椒、干姜、赤石脂（包煎）文火煎15min，过滤汤液，后再加8倍体积的水文火煎煮15min，
过滤汤液，将2次煎煮的汤液混匀浓缩备用。
谢宇风1.3试剂苏木素-伊红（HE）染试剂盒（北京索莱宝科技有限公司，批号G1120）o C反应蛋白（CRP）、白细胞介素（IL）-6、脑钠肽（BNP）试剂盒
-1692 -中国老年学杂志2021年4月第41卷折叠式集装箱
（北京华英生物技术研究所）；心肌缝隙连接蛋白 （CX ） 43蛋白抗体（美国Proteintech 公司，批号： 26980-1-AP ）o
1.4仪器BL-420S 型小动物生物机能实验系统；
HX-100E 型小动物呼吸机（成都泰盟科技有限公
司）,CA-600型全自动凝血分析仪（希森美康医用 电子有限公司），生物显微镜（型号：Motic Panthera
i ），奥林巴斯倒置荧光显微镜（型号:Dp80）。
1.5模型制备及分组给药 将SPF 级SD 雄性大 鼠适应性饲养1 w 后，随机分成正常组、模型组、乌
头赤石脂丸方低、中、高剂量组、尿激酶组，除正常组手持gps怎么量测
以外，其余组分别采用结扎冠状动脉左前降支的方 法制备AM1模型。术后第2天开始给药，正常
组常规饲养，模型组用等量生理盐水灌胃，乌头赤石
脂丸组予乌头赤石脂丸浓缩液，尿激酶组予以尿
激酶2. 5万U/只腹腔注射。连续给药7 d 。
1.6心肌组织HE 染 取下的心肌组织用预冷生
理盐水进行清洗干净，放入4%的多聚甲醛溶液中, 于近心尖部的位置横行切片,HE 染，镜检照相。
循环氢压缩机1.7心肌组织免疫荧光染 脱蜡和水化，抗原热
修复，内源性过氧化物酶灭活，封闭，一抗孵育，二抗
孵育封片，荧光显微镜下观察心肌组织CX43蛋白
含量表达的情况。
1.8血清指标检测及凝血四项指标的测定腹主
动脉采血6 ~ 8 ml，静置30 min，离心机3 500 r/min
离心 15 min ， 取 上 清 液， 酶 联 免 疫 吸 附 试 验 检 测 CRP 、1L-6、BNP 的含量；按照全自动凝血分析仪的
操作流程进行操作，测定凝血酶原时间（PT ）、活化
部分凝血活酶时间（APTT ）、凝血酶时间（TT ）和纤
维蛋白原（Fbg ）。
1.9统计学方法 采用SPSS20.0软件进行t 检验。
2 结 果
2.1乌头赤石脂丸方对AM1大鼠心电图的影响
与正常组比较，模型组心电图见心肌缺血改变，ST 段弓背型显著抬高。与模型组相比较，乌头赤石脂
汤各剂量组及尿激酶组心电图均有ST 段降低或病
理性Q 波。见图1o
MjfUj
1.00.70.50.200.20.50.71.0
2.02.72.9
3.20.50.40.20.1
0.10.20.40.50.60.7
乌头赤石脂汤高剂量组0792」.................一.............................0 400.0 800.0 1 200.0 1 600.0 2 000.0 2 400.0 2 800.0心率：422次/min
7257mV 0.7
0.5
0.20
0.20.50.7
1.01.2
1.5
0 400.0 800.0 1 200.0 1 600.0 2 000.0 2 400.0 2 800.0
心率：451次/min
尿激酶组
200.0 400.0 600.0 800.0 1 000.0 1 200.0 1400.0 1600.0 1800.0心率:394次/min
正常组
400.0 800.0 1 200.0 1 600.0 2 000.0
心率:397次/min
自动检票
乌头赤石脂汤低剂量组
0 400.0 800.0 1 200.0 1 600.0 2 000.0 2 400.0 2 800.0
心率：425次/min
乌头赤石脂汤中剂量组
0.50.2 00.20.50.71.02.9
0 200.0 400.0 600.0 800.0 1 000.0 1 200.0 1400.0 1600.0 1800.0 2000.0
心率:38次/min
模型组
图1乌头赤石脂丸方对急性AMI 大鼠心电图的影响
谢璐璐等 乌头赤石脂丸方对急性心肌梗死大鼠血清炎症因子及心肌CX43蛋白表达的影响 第8期-1693 -
2.2 乌头赤石脂丸对AMI 大鼠CRP 、IL-6、BNP 的
影响 与正常组比较，模型组血清中CRP 、IL-6、 BNP 含量显著增加(P <0. 01, P <0. 05)；与模型组比
较，乌头赤石脂丸低、中、高剂量组血清中CRP 、IL-6、BNP 含量均显著降低(P <0. 01, P <0. 05)，尿激酶
组 CRP 、BNP 显著降低(P <0. 05 ,P <0. 01)，见表 1。
表1乌头赤石脂丸对AMI 大鼠CRP 、IL-6、BNP 及凝血四项的影响(x 土s ,n = 6)
组别CRP(mg/L)IL-6 (pg/m l)BNP( pg/ml)PT(s)APTT(s)TT(s)Fbg (附L)
正常组 1.07±0. 1780. 18±8. 2113. 28±3.2914. 4±0. 5732. 96±5. 7129. 27±5. 01 1.49±0. 33模型组
4. 95±0. 241)
120. 64±15.471)16. 77±0. 972)
14. 51±0. 5940. 35±3. 131)
31.72±7. 51
1.93±0. 492)乌头赤石脂汤低剂量组
2. 75±0. 453)10
3. 87±10. 374)1
4. 94±2. 54)
15. 26±1.5431.94±2. 963)28. 07±1. 820. 55±0. 063)乌头赤石脂汤中剂量组 2. 77±0. 383)97.49±19. 653)
14. 50±1. 114)12. 91±0. 644)27.6±3. 883)25.07±3.043)
0. 94±0.633)
乌头赤石脂汤高剂量组
2. 47±0. 743)9
3.96±9. 853)13.68±0. 923)
13. 35±0. 354)27.6±3. 883)25. 61±3. 353) 1.27±0.413)尿激酶组
3.68±0. 844)
123. 61±12. 3413.71±1.493)
14. 43±0. 76
35. 87±8. 29
33. 65±6. 20
0. 75±0. 333)
与正常组比较：1)P <0. 01,2)P <0. 05 ；与模型组比较：3)P <0. 01,4)P <0. 05
2. 3乌头赤石脂丸对AMI 大鼠凝血四项的影响 与模型组比较，乌头赤石脂丸中、高剂量组PT 、TT
时间降低(P <0. 05,P <0. 01)，乌头赤石脂丸低、中、
高剂量组APTT 时间降低(P <0. 01),Fbg 含量减少
(P <0.01)，差异均有统计学意义。见表1。
2・4乌头赤石脂丸方对AMI 大鼠心肌组织形态学 的影响 正常组可见心肌细胞着均匀，细胞核位 于细胞中央，核大小及形态正常；模型组可见心肌纤
维扭曲断裂，肌丝排列疏松紊乱，细胞着不均匀,
部分细胞核固缩，心肌细胞数量减少，且有大量炎性 细胞浸润；乌头赤石脂汤低、中、高剂量组及尿激酶
组心肌形态均有不同程度的明显改善，其中低剂量
组心肌纤维仍有轻度扭曲，排列不整齐，炎性细胞散
在分布的情况，中剂量组及高剂量组的心肌纤维排 列趋于整齐，炎性细胞浸润减轻，高剂量组心肌损伤
改善明显，与尿激酶组趋于相同，见图2。
正常组 模型组 乌头赤石脂汤低剂量组乌头赤石脂汤中剂量组乌头赤石脂汤高剂量组 尿激酶组
图2乌头赤石脂丸方对AMI 大鼠心肌组织形态学的影响(HE ,x400)
2・5 乌头赤石脂丸方对AMI 大鼠心肌组织中 CX43蛋白含量的影响正常组心肌大量表达CX43
蛋白(0. 391 ±0. 031)，表达产物为蓝荧光，在心肌
中分布均匀；模型组CX43蛋白表达(0. 304±0. 012) 明显下降，分布不均匀，心肌纤维扭曲紊乱；乌头赤
石脂汤低、中、高剂量组心肌CX43表达(0. 350 ±
0. 005、0. 353±0. 015、0. 365 ±0. 020)不同程度的上
调，分布较为均匀，且心肌纤维排列整齐，中剂量组 和高剂量组尤为明显；尿激酶组心肌组织中CX43
蛋白表达(0. 328±0. 022)增加，散在分布，心肌纤维
排列较为整齐，见图3。
正常组 模型组 乌头赤石脂汤低剂量组乌头赤石脂汤中剂量组乌头赤石脂汤高剂量组 尿激酶组
蒙自水芹图3免疫荧光染观察乌头赤石脂丸方对AMI 大鼠心肌组织中CX43蛋白含量的影响(x400
)
-1694-中国老年学杂志2021年4月第41卷
3讨论
早期的药物溶栓是AMI发生后临床首选的方案，以通过及时恢复冠状动脉血流的方式来保护心肌细胞，减少心肌细胞的坏死，抑制心室重构的发生，延缓心功能恶化。AMI后心肌细胞的坏死促使了炎症反应的发生，过度的炎症反应则会扩大心肌缺血的范围并造成心肌进一步的损伤，加剧了心室重构和心肌纤维化发展的进程，严重影响了患者的心功能，增加了发生心律失常、心力衰竭等的风险，降低了急性心血管病患者的生存率〔6〕。
有研究表明，心功能的恶化与AMI患者的血清炎性因子水平呈负相关，因此CRP、IL-6、BNP水平的升高提示了心肌损伤的程度，所以血清炎性因子的水平对判断AMI的预后有十分重要的实际意义〔7,8〕。基于此，本研究进一步探究了AMI后血清炎性因子的水平对心功能的影响。CRP是由肝脏分泌的炎症反应蛋白，AMI时CRP升高且与AMI面积呈正相关。CRP作为炎症反应常见的介质，在急性血栓形成过程中起到促进作用，是预测AMI发生的重要标志物〔9〕。炎症反应是否进一步参与AMI 的心室重构，影响AMI的预后已成为研究的新热点。IL-6是一种单链糖蛋白细胞因子，是急性炎症时由单核细胞等分泌的蛋白〔10〕。在机体抗感染的免疫反应中IL-6起到了十分重要的作用，是诊断急性感染早期的灵敏指标。BNP主要由心肌细胞合成分泌，是一种心脏神经类激素，主要反映心室肌的张力和心脏容量负荷的改变，也是反映机体心功能的重要因素〔"〕。急性心肌缺血能够刺激脑钠肽的分泌，且参与AMI的心室重构，严重心室重构则导致心力衰竭的发生，因此BNP的早期监测对于AMI 预后有十分重要的意义。
乌头赤石脂丸主要用于AMI等急性心血管疾病，主要病机为“阳微阴弦”，即上焦阳气极虚、下焦阴寒痼结、痰饮闭阻心胸而发病。方中乌附为大辛大热的药物，实为峻逐阴寒、除湿化饮止痛之品，同用可急救于危难之时，迅速起效；蜀椒、干姜散其寒以振奋阳气、调畅气血，在一派大辛大热的药物之中，配伍赤石脂既可以收敛阳气，也能固涩止血又可防止辛温药物发散太过。现代药理学研究表明，乌头和附子具有抗心肌缺氧、抗凝血和抗心律失常等作用，附子还具有改善血液循环，促进血流量的
作用，临床研究中发现附子可抑制急性炎症〔12〕。干姜主要的化学成分是挥发油，其中a-姜烯含量最高，具有解热、抗炎、抗氧化、抑制血小板聚集的作用，其中挥发油中所含的辛辣成分有改善局部血液循环的作用，实验研究表明，干姜水煎剂可以通过调控AMI 大鼠血清中炎症因子的含量达到改善心肌缺氧的状态目的。基于附子无干姜不热的理论基础，研究表明附子与干姜的配伍可减少心肌细胞凋亡而保护心肌细胞〔13，14〕。蜀椒中主要含有的有效成分是挥发油，其中桉树脑、4-萜品醇、D-柠檬油精、0-月桂烯、a-蒎烯含量较高，有研究表明蜀椒所含的挥发油对于急慢性炎症有很好的抑制作用，且有一定的镇痛作用〔15〕。乌头赤石脂丸方诸药合用才能更好地发挥温阳散寒、祛寒止痛的功效。有临床实践证实，乌头赤石脂汤可以改善老年缺血性心肌病，提高患者生活质量，其可能与降低血清中TNF-a、BNP的水平 有关〔16〕。
综上，乌头赤石脂丸方可以显著改善AMI大鼠模型的心功能，降低血清炎性因子CRP、IL-6的水平，有效地抑制心肌细胞凋亡；降低血清中BNP的含量，一定程度上抑制了心肌纤维化，延缓了心室重构的进程；可延长凝血酶原时间，降低纤维蛋白原的含量，改善了其血液黏度，防止血栓进一步形成而造成二次伤害；心肌细胞CX43蛋白表达有效增加，缝隙连接蛋白正常工作，减少心律失常和心力衰竭的发生，有效改善了心肌纤维化。
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〔2020-05-01修回〕
（编辑王一涵）
上调VEGF-B基因对慢性心力衰竭大鼠的作用及机制
陈磊吴小燕（海南医学院第二附属医院心内科，海南海口570100）
〔摘要〕目的研究上调血管内皮生长因子（VEGF）-B基因对慢性心力衰竭大鼠作用及机制。方法取大鼠心肌细胞，转染VEGF-B基因，转染为下调、上调基因细胞，随机选取40只小鼠中的10只作为对照组，另外30只建立慢性心力衰竭模型，建模成功后随机分为模型组、下调组、上调组各10只，之后将转染的下调、上调VEGF-B基因细胞注入至下调、上调大鼠心肌组织中，另外两组不做处理。观察大鼠心肌病理变化，检测心功能、心室重构情况及心肌细胞内Ca2+浓度，心肌组织钙调神经磷酸酶（CaN）、T细胞活化因子（NFAT）3及磷酸化（p）-NFAT3蛋白表达量。结果与对照组相比，模型组、下调组、上调组大鼠左心室收缩压（LVSP）、左心室内压力上升的最大速率（+dp/dt）、左心室
内压力下降的最大速率（-dp/dt）均明显降低, SI均明显缩小，左心室舒张压（LVEDP）、心率、心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白均明显升高，左心室质量（LVAM）、左心室质量指数（LVMI）均明显增大（P<0.05）；与模型组比较，下调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显降低，球形指数（SI）明显缩小丄VEDP、心率、心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显升高，LVAM、LVMI明显增大，上调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显升高，LVAM、LVMI明显增大，SI明显缩小，LVEDP，心率、心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显降低（P<0.05）；与下调组大鼠相比，上调组大鼠LVSP、+dp/dt、-dp/dt均明显升高,SI增大,LVEDP、心率、心肌细胞中Ca2+浓度、心肌组织中CaN活性、NFAT3、p-NFAT3蛋白表达量均明显降低丄VAM、LVMI明显缩小（P<0.05）。结论下调VEGF-B表达通过作用于Ca2+-CaN-NFAT3信号通路，改善心室重构，最终起到改善慢性心力衰竭大鼠心脏功能的作用。
〔关键词〕血管内皮生长因子B基因；慢性心力衰竭；钙调神经磷酸酶;T细胞活化因子3
〔中图分类号〕R541〔文献标识码〕A〔文章编号〕1005-9202（2021）08-1695-05;doi:10.3969/j.issn.1005-9202.2021.08.039
慢性心力衰竭属于心功能逐渐减退的病理过程，当心力衰竭出现后，心脏会在疾病的作用下导致引起
心肌重构，进而导致心功能出现进行性的下降⑴。有研究表明〔2〕，慢性心力衰竭的基本病理机制为心肌重构，当心脏结构发生改变后，心肌舒张功能出现障碍，心排血量明显不足，不能满足机体所需要的代谢需求，其临床表现为日常活动受限，伴随着不同程度的呼吸困难，属于多种心血管疾病的终末阶段。血管内皮生长因子（VEGF）-B属于VEGF家族中的成员，具有促血管生成、保护神经、供给机体营养的作用，并参与脂质代谢等生物学过程〔3〕。
基金项目：海南省卫生计生行业科研项目（14A200073）
通信作者：吴小燕（1982-），女，副主任医师，主要从事临床心血管疾病研究。
第一作者：陈磊（1981-），男，硕士，副主任医师，主要从事心血管疾病研究。VEGF-B作为一种促进血管生成因子，具有促进心肌血管新生和促进心肌血管内皮的增殖的作用⑷。有研究表明〔5〕，低水平的VEGF-B和心脏疾病中发生心室重构、左心室功能有关。本研究观察上调VEGF-B基因对慢性心力衰竭大鼠作用及机制。
1材料与方法
1.1材料研究动物：选取SPF级SD健康大鼠40只，由济南朋悦实验动物繁育有限公司提供，鼠龄（3.9±0.6）个月，体重（225.8±11.5）g o所有大鼠养殖在干净笼子里，室温（2
2.1±1.8）^，相对湿度35%~40%，每天光照12h，喂饮纯净水，饲养时间1w。本研究所做实验均获得医院伦理委员会批准。
主要试剂:Lipofectmine2000转染试剂盒（购于北京义翘神州科技有限公司）,RPMI1640培养基（购于武汉纯度生物科技有限公司），Ca试剂盒、
豫公网安备41160202000603
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