《食品微生物学实验》是为生物工程、生物技术等专业选修课程《食品微生物学》开设的实验，包括两部分内容：一是微生物发酵食品加工，如甜酒酿的酿制，酸乳的制作、豆腐乳的制作、面包的制作等；二是食品中微生物的检验，包括常规检验如菌落总数、大肠菌的检验和致病性微生物的检验等。 第一篇 微生物食品加工
实验一 甜酒酿的制作
一、目的
1、通过甜酒酿的制作了解酿酒的基本原理。
2、掌握甜酒酿的制作技术。
二、原理
以糯米（或大米）经甜酒药发酵制成的甜酒酿，是我国的传统发酵食品。我国酿酒工业中的小曲酒和黄酒生产中的淋饭酒在某种程度上就是由甜酒酿发展而来的。
甜酒酿是将糯米经过蒸煮糊化，利用酒药中的根霉和米曲霉等微生物将原料中糊化后的的淀粉糖化，将
蛋白质水解成氨基酸，然后酒药中的酵母菌利用糖化产物生长繁殖，并通过酵解途径将糖转化成酒精，从而赋予甜酒酿特有的香气、风味和丰富的营养。随着发酵时间延长，甜酒酿中的糖分逐渐转化成酒精，因而糖度下降，酒度提高，故适时结束发酵是保持甜酒酿口味的关键。
三、材料
1、材料：糯米、酒药
2、仪器和器具：手提高压灭菌锅，不锈钢丝碗，滤布，烧杯，不锈钢锅。
四、流程
原料选择→洗米蒸饭→淋水降温→落缸搭窝→接种→保温发酵→后熟→质量评估
五、方法
1、洗米蒸饭
将糯米淘洗干净，用水浸泡4h，捞起放于置有滤布的钢丝碗中，于高压锅内蒸熟（约0.1Mpa，9min），使饭"熟而不糊"。
2、淋水降温
用清洁冷水淋洗蒸熟的糯米饭，使其降温至35℃左右，同时使饭粒松散。
snis8723、落缸搭窝
将酒药均匀拌入饭内，并在洗干净的烧杯内洒少许酒药，然后将饭松散放入烧杯内，搭成凹形圆窝，面上洒少许酒药粉。盖上培养皿盖。
4、保温发酵
于30℃进行发酵，待发酵2天后，当窝内甜液达饭堆2/3高度时，进行搅拌，再发酵1天左右即可。
六、结果
1、发酵期间每天观察、记录发酵现象。
2、对产品进行感官评定，写出品尝体会。
七、思考
1、制作甜酒酿的关键操作是什么？
2、发酵期间为什么要进行搅拌？
实验二 酸乳的制作主板维修工具
一、目的
1、掌握酸乳制作原理
2、学会酸乳的制作方法
二、概述
酸奶因具有清新爽口的味觉而倍受欢迎 , 又由于酸乳中会有乳酸菌的菌体及代谢产物，它对肠道内的致病菌有一定的丑掣作用，故对人体的肠道消化道疾病有良好的效果。 三、原理
酸乳是以牛乳为主要原料，接入一定量的乳酸菌，经发酵后而制
成的一种乳制品饮料，当乳酸菌在牛乳中生长繁殖和产酸至一定程度时,pH下降，使乳酪蛋白在其等电点附近发生凝集，这种凝乳状酸奶称为凝固型酸奶。
四、器材
鲜牛奶、奶粉、蔗糖、菌种(或市售酸乳)、天平、烧杯、玻璃棒、牛奶瓶、恒温水浴锅、恒温培养箱、冰箱、不锈钢锅。
五、方法
（一）凝固型酸奶制作
在添加生产发酵剂后立即进行包装，并在包装容器中发酵而成，成品呈凝乳状。
1、工艺流程
蔗糖、脱脂奶粉
↓
原料鲜奶一→净化一→脂肪含量标准化一→配料一→过滤一→预热一→均质一→杀菌-→冷却-→接种一→分装一→发酵一→冷却一→后熟。 2、操作步骤
（1）牛奶瓶消毒：
将牛奶瓶在不锈钢锅里用沸水煮15分钟。
（2）牛乳的净化：
利用特别设计的离心机，除去牛乳中的白血球和其他肉眼口见的异物。
（3）脂肪含量标准化：
鲜奶中脂肪含量比较高，为了避免酸奶中有脂肪析出，因此需要对鲜奶的脂肪含量进行调整使其达到所要求的标准。可以在脂肪含量高的牛乳中，加入一定体积的脱脂乳，或通过分离机，从牛乳中分离出稀奶油，然后在得到的脱脂乳中再掺入一定量稀奶油，使调制乳的脂肪含量达到要求。
（4）配料
a.奶粉的添加：经脂肪含量标准化处理的调制乳(或按1：7的比例加水把奶粉配制成复原牛奶)，为了使其非脂干物质含量达到要求，一般往调制乳中添加脱脂奶粉，经如此处理的酸奶有一定的硬度，脱脂奶粉的添加量一般为1%-3%。
b.蔗糖的添加：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶的口味，一般在调制乳中加入4%-8%的蔗糖，如果蔗糖量加入过多，会因调制乳渗透压的增加而阻碍乳酸菌主长一般是先将原料乳加热到60℃左右，然后加入蔗糖，待糖溶解后，过滤除杂，经过滤的奶液再进行均质处理。
（5）均质：
用于制作酸奶的原料乳一般都要进行均质处理，经过均质处理，乳脂肪被充分分散酸奶不会发生脂肪上浮现象，酸奶的硬度和粘度都有所提高，而且酸奶口感细腻，更易被消化吸收，将加热和均质两种方法适当结合起来，处理的效果会更好，一般是先将原料乳地垫至60℃左右，然后在均质机中，于8-1OMpa压力对乳进行均质处理。
加热搅拌反应釜
（6）灭菌：
均质后的原料乳的灭菌方法大致有两种：将乳加热至90℃，保温5min，或置于80℃恒温水浴锅中灭菌15分钟，也可用超高温瞬时灭菌法（在135℃下保温2-3s）。灭菌目的有以下几点：
①杀灭原料乳中的微生物，特别是致病菌。
②形成乳酸菌生长促进物质，破坏乳中存在的阻
碍乳酸菌生长的物质。
③除去原料乳中的氧及由于乳清蛋白的变性而增加的-SH，从而使氧化还原电位下降，助长乳酸菌的生长。
④使乳清蛋白变性膨润，从而改善酸奶的硬度和粘度，并阻止水分从变性酷蛋白凝聚成的网状结构中分离出来。
⑤灭菌后，使乳中原本存在的酶失活，使发酵过程成为单一乳酸菌的作用过程，易于控制生产。
经灭菌处理后的原科乳迅速冷却到43-45℃待接种。
（7）接种：
向43-45℃灭过菌的原料乳中加入工作交酵剂，接种量为2-3%，通常是嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌的混合菌，两种菌的比例为1:1或2：1。球菌的接种量稍多些，可弥补由于杆菌生长产酸而阻碍球菌生长所造成的球菌数量不足的缺点。经实验证明，当接种量超过3%时，发酵所需时间并不因种量加大而缩短，而酸奶的风味由于发酵前期酸度上升太快反而变差，所以，任意加大接种量是无益的，反之，若接种量过小，发酵所需时间延长，酸奶的酸味会显得不够。
（8）分装：
酸奶受到振动，凝乳状态易被破坏，因此，不能在发酵罐中先发酵然后再进行。分装，必须是将会有乳酸菌的牛乳培养基先分装到销售用的玻璃瓶或塑料小容器中，加盖后送入恒温室培养，在容器中发酵制成酸奶，为了避免杂菌的侵入，分装操作应在无菌室中进行。牛乳分装后，容器上部留出的空隙要尽可能小，这样容器中的内容晃动幅度小，酸奶的形态易保持完整，另外，减少空气也有利于乳酸菌的生长。整个分装操作的时间要短，使乳液温度下降少，这样乳液温度与所设定的发酵温度接近，整个发酵时间就不会被延长。
（9）发酵:
将装有含乳酸菌的牛乳的容器置于恒温箱中进行发酵，恒温箱的温度保持在40-43℃，时间为3-4小时，或30℃培养18-20小时，发酵终点的确定有两种方法:
a.发酵奶的酸度已达到65-70oT,[用0.1moL/L NaOH 标准溶液滴定10ml样品，每消耗掉 1mLNaOH溶液称为1滴定酸度(oT)]或PH=4-5；
b.发酵奶的流动性变差，基本凝固。
(10)冷却:
发酵结束，在将酸奶移放进冷藏室进行贮存和后熟处理之前，应将酸奶从发酵室中取出，用冷风迅
速将其冷却到10℃以下使酸奶中的乳酸菌停止生长，防止酸奶酸度过高而影响口感。
(11)后熟:
酸奶在形成凝块后应在4-7℃下保持24小时以上，以获得酸奶特有风味和较好口感。
(12)冷藏:
经冷却处理的酸奶贮藏在2-5℃，最好是-1-0℃的冷藏室保存，低温保存有以下优点:
①保存期间，酸奶的酸度上升极少；
②牛乳凝固时会产生收缩力，导致乳清折出，在低温时这种收缩力比较弱，所以乳清不易从酸奶中分离出来；
③低温下酸奶逐渐形成白玉般的组
织状态，结构非常细腻；
④低温保存过程中，香味物质逐渐形成，使酸奶具有较浓香味。
(13)品味：
酸奶应有凝块，质地细腻，酸甜适中，清新爽口，若有不良异味，则很可能是酸奶污染了杂菌。
（二）搅拌型酸奶的制作
在发酵罐中接种生产发酵剂，凝固后，再经搅拌入杯成其它容器中，产品凝乳粒子直径保持在0.01-0.04mm大小。呈半流动状态的粥糊状，易使用吸管吸食。
1、工艺流程
原料鲜奶→配料→预热→均质→杀菌→冷却→接种→搅拌→发酵→冷却→搅拌混合→装瓶→冷却→后发酵 ↑
辅料
2、操作步骤(略)
(三)饮料型酸奶
将凝固型酸奶均质处理后，使凝乳充分分散，凝乳粒子直径在0.01mm以下的酸奶，这种酸奶的特点是与牛乳相似，呈液体状。
1、工艺流程
凝固型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏
↑
稳定剂溶液
2、操作步骤
(1)凝固型酸奶的制备(略)
(2)混合:
为了防止饮料型酸奶产生分层现象，一般在疑固型酸奶中加入稳定剂，然后再用均质机破乳，由于增加了稳定剂，即使在冷藏期间也不会发生酸奶分层现象。根据来源，可将稳定剂分成两类:
①人工合成稳定剂，如海藻酸丙二醇酶(PGA)等；
②天然稳定剂，如明胶、琼脂、海藻酸纳和果胶等。稳定剂的种类、添加量和添加方式，对于制备凝固塑酸到十分重要。
目前在酸奶中使用得较多的是低甲氧基果胶(LM果胶)。一般加入量为0.3%，使用时，先将LM果胶用水溶解，经灭菌后冷却到接近酸奶的温度(20-15℃)，然后加入酸奶中搅匀。
(3)均质:
在1OMPa压力下，将上述酸奶进行均质处理。
(4)分装:
均质后的酸乳液，灌装到销售用的小容器中后，迅速冷却到10℃以下。
(5)冷藏:
饮料型酸奶会有活乳酸菌，因此应置于O-5℃冷藏。
(四)果汁酸奶
果汁酸奶是在凝固型酸奶中添加果汁和稳定剂后，再经均质处理制成的。
1、工艺流程
低酸味凝固型酸奶→混合→均质→分装→冷却→冷藏
↑
果汁、稳定剂
2、操作步骤
(1)低酸味凝固型酸奶的制备:
果汁(露)的添加会增加酸奶的酸味，因此在接种时，将嗜热链球菌与保加利亚乳杆菌两者的比例改变成10:1，目的是减少保加利亚乳杆菌产生的乳酸，这样可避免产生酸味过强，制备低酸味凝固型酸奶的其它操作步骤，与一般凝固型酸奶的制法相同。
(2)混合:
将酸奶和灭菌后冷却到15-20℃的果汁(露)按4:1混合，同时加入适量灭过菌的稳定剂水溶液，搅拌均匀。
(3)均质:
在1OMpa压力下，将上述酸奶进行均质处理。
(4)分装:
将经均质处理过的果汁酸奶乳液灌装到销售用的小容器中，迅速将其冷却到10℃以下。
(5)冷藏:
冷却后的酸奶，置于O-5℃的冷藏室中冷藏。
(五)杀菌型酸奶
由牛乳制成酸奶后，用加热方法将酸奶中所有微生物杀灭的一种酸奶，此种酸奶特点是：不存在乳酸菌和其它微生物，保存期中酸奶酸度不会改变，且保存期延长，但凝乳经加热后，十分容易折出乳清，需在发酵前加稳定剂，灭菌后酸奶的营养价值也有所降低。
1、工艺流程
糖、奶粉、稳定剂 ┌--搅拌型酸奶--┐
↓ ┌发酵-杀菌-┤ ├-无菌分类
脂肪含量标准化牛乳→配料→过滤→均质→分装 └--饮料型酸奶--┘
└-发酵-杀菌-凝固型酸奶
2、操作步骤
杀菌型酸奶除多了一步杀菌工序外，其它操作步骤与凝固型酸奶基本相同。
杀菌：微生物在酸性环境中对温度十分敏感，当PH为4.O-4.5时,65℃加热5min就能够把酸奶中的微生物杀死制作杀菌型酸奶常使用这种方法。其它步骤(略)。
(六)冷冻酸奶
在酸奶中添加糖和香料，按照冰淇淋生产工艺加工成保健饮料。按冷冻酸奶是否含有活菌，可将其划分为活菌型冷冻酸奶和杀菌型冷冻酸奶两种类型活菌型冷冻酸奶在-25℃贮藏一年活乳酸菌残存50%-80%，杀菌型冷冻酸奶是将酸奶中活乳酸菌杀死因此成品性能稳定。
1、工艺流程
糖液→杀菌→冷却
↑
酸奶→混合→均质→搅拌、分装→搅拌型冷冻酸奶→冷藏
冰铲 ↓ ↓
香料 快速冷冻(-35℃)→凝固型冷冻酸奶→冷藏
2、操作步骤
(1)牛乳的净化、脂肪含量标准化和配料的操作方法与制作凝固型酸奶相同。
(2)将原料加热至75℃，然后用均质机进行二段均质(均质压力为13.538Mpa,3.434Mpa)
(3)均质后的乳加热到85℃，保温10min，接着将此灭菌奶冷却到44℃。
(4)接种保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌的混合菌液(1：1)，接种量为2%-3%。
(5)在43℃左右发酵6-7h，终止时酸奶的pH值为4.7-5.0。
(6)在上述酸奶中添加经杀菌冷却的糖液和香料，充分混合后，在143Mpa 压力60 ℃下均质，接着，将均质奶冷却到45℃，成熟数小时后分装。最后送入-35℃冷库，快速冷冻硬化，得到凝固型冷冻酸奶，也可以将成熟后的酸奶不经过冷冻硬化，在分装后直接冷藏保存制成搅拌型冷冻酸奶。
六、注意事项
(1)选择优质、新鲜的牛奶和酸奶(作为菌种)。
(2)严格无菌操作，尽量避免杂菌污染。
(3)酸
乳制好后，应在O-5℃下保藏，保质期为5天。
附一：原料奶质量要求
a.来源于健康牛所产的乳，泽呈乳白或微黄，气味芳香、无异味初乳、末乳、细菌污染乳均不得使用。
b.乳牛注射抗生素后所产出乳，四天内不得使用。生产前应做小样。
c.总乳固体不低于11.5%，非脂乳固体大于8.5%。
d.原料中不得含碱及菌剂等杂质。
e.奶温不高于10℃,70度酒精试验无絮状物沉淀。
附二：酸牛奶卫生标准
1、感官指标
呈乳白或和稍带淡黄，具有清香纯净的乳酸味，凝块稠密结实均匀，无气泡，允许少量乳清折出。
2、理化指标
项目
指标
脂肪含量/%
≥3.0
酸度（以乳酸计）/%
0.63-0.99
汞含量（以Hg计）mg/kg-1
≤0.01
3.细菌指标
音箱制作项目
指标
大肠菌/个（100mL）-1
≤90
致病菌（系指肠道致病菌及致病性球菌）
不得检出
实验三 面包的制作
一、目的
1、掌握面包制作的原理、工艺。
2、学会面包的制作方法。
二、概述
面包是产小麦国家的主食，几乎世界各国都有生产。它是以面粉为主要原料，以酵母菌、糖、油脂和鸡蛋为辅料生产的发酵食品，其营养丰富，组织蓬松，易于消化吸收，食用方便，深受消费者喜爱。
三、原理
酵母加入面粉和水的混和合物中后，在28℃左右的温度下，利用面粉中含有少量单糖与蔗糖开始生长繁殖，在生长繁殖的同时，面粉中的β-淀粉酶能将面粉中的淀粉转化为麦芽糖。
β-淀粉酶
2(C6H1005)+2nH20────→n(C12H22011)
淀粉 麦芽糖
麦芽糖的增加，为酵母菌进一步生长发酵提供了可利用的营养物质。酵母菌菌体本身能够分泌麦芽糖酶和蔗糖酶，将麦芽糖和蔗糖分解成单糖，供酵母菌利用。
麦芽糖酶
(C12H22011)+H20────→2C6H1206
麦芽糖 葡萄糖
蔗糖转化酶蜗轮滚刀
(C12H22011)+H20────→C6H1206+ C6H1206
蔗糖 葡萄糖 果糖
酵母菌利用这些糖类及其它营养物质先后进行有氧呼吸和无氧呼吸，产生二氧化碳、醇、醛和一些有机酸等产物。
有氧呼吸
C6H1206+6O2────→6CO2+6H20+674千卡
无氧呼吸
C6H1206────→C2H5OH+2CO2+24千卡
生成的二氧化碳由于被面团中的面筋包围，不易跑出，留在面团内，从而使面团逐渐胖大。发酵后的面团，经揉搓成型醒发后，放入200℃左右的烤炉中烘烤。由于面团内的二氧化碳受热膨胀，逸散，从而使面包充满多孔，形成海绵状。
在发酵中形成的其它物质如乙醇、乳酸、醋酸、醛酮类等有机化合物，在烘烤中形成了面包特有的香味。
四、原料与器材
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