1. 大纲要求
1.1.1.光学显微技术
1.1.1.1 了解普通复式光学显微镜：掌握分辨率及计算公式，像差与复合透镜 1.1.1.2 了解观察样品的一般制备：固定、切片、染 1.1.1.3了解荧光显微镜与观察样品的荧光染
1.1.1.4 了解暗视野显微镜：聚光器，分辨率
1.1.1.5了解相差显微镜：用途、特有装置（光栏、相版），原理
1.1.1.6了解干涉显微镜：用途、特有装置 干涉器
1.1.1.7了解激光共聚焦扫描显微镜及其原理、用途
1.1.1.8了解计算机等技术在光学显微技术中的应用
1.1.2.电子显微镜技术
1.1.2.1了解透射电镜：基本构造，成像原理，分辨率；超高压电镜
1.1.2.2了解透射电镜观察样品制备：超薄切片技术，负染和暗视场制片术冰冻劈裂一复型技术和金属投影技术
1.1.2.3了解扫描电镜和隧道电镜及其原理和用途
延时冲洗阀1.2. 细胞化学组成及其定位和动态分析技术
等离子发动机1.2.1理解细胞和细胞器的分离：如匀浆和差速离心技术等
1.2.2理解基本生物化学和分子生物学技术
1.2.3理解细胞化学、免疫荧光细胞化学、细胞光度和流式细胞分离技术
1.2.4了解电镜细胞化学和电镜免疫细胞化学技术
1.2.5了解显微放射自显影、分子原位杂交
1.3. 了解细胞培养、细胞工程、显微操作、活体染等技术方法
2. 大纲详解
2.1. 观察细胞形态结构的技术方法和仪器
2.1.1.光学显微技术
2.1.1.1 了解普通复式光学显微镜：掌握分辨率及计算公式，像差与复合透镜
分辨率：是指区分开两个质点间的最小距离，是任何显微镜最重要的性能参数。分辨率的高低取决于：官员的波长λ、物镜的镜口角α和介质的直射率N，它们之间的关系为D=0.61λ/N sin(α/2)
2.1.1.2 了解观察样品的一般制备：固定、切片、染
为了便于光学显微镜、电子显微镜进行观察，经过固定、切片、染等操作步骤更易于
进行。因为细胞内部的主要成分是蛋白质和水，所以固定主要是依靠蛋白质的凝固变性或水的冷冻来进行的，前者是固定液或加热来固定的，后者是通过急速冷却来固定的。
用甲醛、甲醇、乙酸等固定，石蜡等包埋，切成0.5μm的薄片后染。一般用伊红美蓝染蛋白质，苏木精、甲绿和地衣红染DNA 等。
2.1.1.3了解荧光显微镜与观察样品的荧光染
荧光显微镜是免疫荧光细胞化学的基本工具。它是由光源、滤板系统和光学系统等主要部件组成。是利用一定波长的光激发标本发射荧光，通过物镜和目镜系统的放大以观察标本的荧光图像。它是以紫外光显微镜基础上发展而来的，利用样品自发荧光和诱发荧光，可以对某些生物大分子进行定性和定位研究。不仅可以观察固定切片标本，还可以在活体染后对活细胞进行研究。
荧光显微镜和普通显微镜有如下区别：① 照明方式通常是落射式，即光源通过物镜投射于样品上。② 光源为紫外光，波长较短，分辨率高于普通显微镜。③ 有两个特殊的滤光片，光源前的用以滤除可见光，目镜与物镜之间的用于滤除紫外光，保护人眼。
2.1.1.4 了解暗视野显微镜：聚光器，分辨率
聚光镜中央有挡光片，使照明光线不直接进入物镜，只允许被标本反射和衍射的光线进入物镜，因而视野的背景是黑的，物体的边缘是亮的。利用这种显微镜能见到小到4-200nm的微粒子，分辨率可比普通显微镜高50倍。
2.1.1.5了解相差显微镜：用途、特有装置（光栏、相版），原理
相差显微镜可以观察未经染的标本和活细胞。光线在通过密度不同的的介质时，其滞留程度不同，即产生了光程差和相位差。相差显微镜的基本原理把光程差变成振幅差（即明暗）。从而提高了样品反差，故样品不需染，适合观察活细胞，甚至研究细胞核、线粒体等细胞器的动态。它与普通显微镜最大的不同是在物镜后装有相差版。
剖分式油封2.1.1.6了解干涉显微镜：用途、特有装置 干涉器
微分干涉显微镜用的是偏振光。光线经棱镜折射后分成两束，在不同时间经过样品的相邻部位，然后再经过另一棱镜将这两束光会合，从而样品中的厚度上的微小区别就会转化成明暗区别，增加了样品的反差，并具有立体感，可用于研究活体细胞中较大的细胞器。
2.1.1.7了解激光共聚焦扫描显微镜及其原理、用途
共焦点是指物镜和聚光镜同时聚焦到同一小点上。他在某一瞬间只用一束通过检测器前的小孔的光成像，可显著提高分辨率。可观察较厚样品的内部结构。
2.1.1.8了解计算机等技术在光学显微技术中的应用
计算机辅助微分干涉显微镜可以得到很高的反差，应用这一技术制备的录像增差显微镜技术可以观察微管上颗粒的运动。计算机技术与激光共聚焦扫描显微镜结合可构建样品的三维图像。等
2.1.2.电子显微镜技术
2.1.2.1了解透射电镜：基本构造，成像原理，分辨率；超高压电镜
基本构造：① 电子束照明系统。② 电磁透镜成像系统。③ 真空系统。④ 记录系统。⑤ 电源系统。
成像原理：在电镜中，作用于被检样品的电子束经过电磁透镜放大后打到荧光屏上成像或
作用于感光胶片成像。其电子浓淡的产别产生的机理是，电子束作用于被检样品时，入射电子与物质的原子发生碰撞产生散射，由于样品不同部位对电子有不同的散射程度，故样品电子像以浓淡呈现。
分辨率：分辨率最终决定于光的波长，由于使用电子束作为光源，电镜的分辨率大大提高。电镜的分辨率常是超薄切片厚度的十分之一，它的分辨率可达0.2nm，其放大倍数为106倍。
超高压电镜：同透射电子显微镜基本相同，只是电压特别高。由于电压高，就会大大减少造成染体畸变的可能，因此，可以用较厚的细胞切片研究细胞结构，切片的厚度最大可达1μm，相当于普通透射电镜样品厚度的10倍。
2.1.2.2了解透射电镜观察样品制备：超薄切片技术，负染和暗视场制片术冰冻劈裂一复型技术和金属投影技术
超薄切片：电子束的穿透力很弱，须将标本制成40-50nm的超薄切片。方法与步骤：锇酸或戊二醛固定样品→丙酮逐级脱水→环氧树脂包埋→以热膨胀或机械伸缩的方式切片→重金属（铀、铅）盐染。
负染技术（Negative staining）：用重金属盐对铺展在载网上的样品染，吸去多余的染料，干燥后整个载网上铺一层重金属盐，衬托样品的特细结构，分辨率可达1.5nm左右。
冷冻蚀刻（Freeze ehching）：即冷冻断裂技术，首先用快速低温冷冻法将样品迅速冷冻；然后在低温下使相对脆弱部位断裂（脂双层断裂，从而显示出镶嵌在质膜中的蛋白质颗粒），用铂、金等金属进行倾斜喷镀，再垂直于断裂面进行碳真空喷镀，形成一层连续的碳膜；最后将样品本身消化，在电镜下观察碳膜和金属铸型。主要用来观察膜断裂面的蛋白质颗粒和膜表面结构，不需包埋和固定，能保持样品的真实结构。
补充：电镜三维重构技术：对样品在电镜的不同倾角下进行拍照，得到一系列电镜图片后再经傅里叶变换等处理，最终展现出生物大分子及其复合物的三维结构的电子密度图。尤其适用于分析难以形成三维晶体的膜蛋白和蛋白质-核酸复合物等大分子复合体。电镜三维重构技术与X-射线晶体衍射技术及核磁共振分析技术相结合，是研究生物大分子空间结构的及其相互关系的主要实验手段。
2.1.2.3了解扫描电镜和隧道电镜及其原理和用途
扫描电镜（scanning electron microscopy,SEM），用来观察标本的表面结构。工作原理是用一束极细的电子束扫描样品，在样品表面激发出次电子，次电子的多少与电子束入射角有关，也就是说与样品的表面结构有关，次电子由探测体收集，并在那里被闪烁器转变为光信号，再经光电管倍增和放大器转变为电信号来控制荧光屏上电子束的强度，显示出与电子束同步的扫描图像，图像为立体形象，反映了标本的表面结构。
扫描隧道显微镜（scanning tunneling microscopy，STM）：根据量子力学原理中的隧道效应而设计制造的。可用来直接观察生物大分子，如DNA、RNA和蛋白质等分子的原子布阵，和某些生物结构，如生物膜、细胞壁等地原子排列。扫描隧道显微镜使用电子学的方法，用一个金属针尖在样品表面扫描，当针尖和样品表面距离很近时（1nm以下），针尖和样品表面之间会产生电压。当针尖沿X和Y方向在样品表面扫描时，就会在针尖和样品表面第一层电子之间产生电子隧道。该显微镜设计的沿Z字形扫描，可保持电流和恒定。因此，针尖的移动是隧道电流的作用，并且可以反映在荧光屏上，连续扫描可以建立起原子级分辨率的表面像。
光学显微镜技术、电子显微镜技术以及扫描隧道显微镜的特点如表
植物水显微镜技术 | 结构与原理 | 优缺点与应用 |
光学显微镜技术 | 普通复式光学显微镜 | 照明系统；光学放大系统（物镜与目镜）；机械支架系统 | 分辨率0.2μm；观察组织需要组织染；直接用于观察单细胞生物体或体外培养细胞；组织固定并染后可区分细胞组分。 |
相差显微镜 | 物镜后装有“相差板”；密度差→光程差（相位差）→振幅差→明暗区别 | 不需染；观察活细胞、某些细胞器（核或线粒体）的运动 |
微分干涉显微镜 | 以平面偏振光为光源 | 观察较大的细胞器 |
荧光显微镜 | 用荧光素直接或者间接标记生物大分子，从而定性定位 | 吹管系数在光镜水平用于特异蛋白质等生物大分子的定性定位，如GFP |
激光共聚焦扫描显微镜 | 入射光点照射；武警和聚光镜共聚焦；针孔消除了其他层面成像 | 分辨率比普通荧光显微镜提高了1.4-1.7倍；排除了焦平面以外光的干扰，增强图像反差和提高分辨率，可重构样品的三维结构 |
荧光共振能量转移技术 | 激发光→供体分子产生荧光（a），受体分子的距离在10nm范围内时，吸收（a）后产生荧光（b），即FRET，此时可测到减弱的（a），并检测到（b） | 检测活细胞中大分子间纳米级距离及距离变化，研究分子间相互作用 |
荧光漂白回复技术 | 高能量激光束的照射是细胞特定区域的荧光发生不可逆的猝灭（漂白）；其他区域的荧光标记分子运动至漂白区（恢复） | 检测活体细胞表面或细胞内部的分子运动以及在各种结构上分子动态变化率 |
电子显微镜技术 | 透射电镜 | 由照明、成像、真空及记录系统构成。以电子束作为光源，用电磁透镜聚焦，利用样品对电子的散射和透射形成明暗反差，最后用荧光屏显示或胶片记录 | 分辨率0.2nm透射电镜的分辨率是 切片厚度的1/10；不能观察活细胞；对样品的要求很高：薄、精细结构完整；基本用途：观察亚细胞结构 |
扫描电镜 | 电子束扫描样品表面激发放出二次电子，构建出立体图像；CO2临界点干燥法能解决样品表面张力问题 | 用于观察样品形貌特征；分辨率相对于普通电镜低；不能观察活的生物样品 |
扫描隧道显微镜 | 利用量子力学中的隧道效应 | 具有原子尺度的高分辨率；无样品条件限制；非破坏性；直接观察生物大分子结构 |
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