过氧化物酶POD活性采用愈创木酚法测定
过氧化氢酶采用过氧化氢法测定
丙二醛采用硫代酸法测定
蛋白质含量采用考马斯亮蓝法 每次测定重复3次，取平均值
测定方法
一．SOD，CAT及POD活性的测定
分别取0.4ｇ材料于预冷的研钵中，加入8 ml预冷的50 mmol-1磷酸缓冲液（pH 7.8）（甲液：取Na2HPO4 35.9g，加水溶解，并稀释至500mL 乙液：取NaH2PO4 2.76g，加水溶解，并稀释至100mL 取上述甲液91.5mL和乙液8.5mL，混合摇匀即得。先加2ml, 在冰浴下
研磨成匀浆后，将匀浆转入10ml离心管，再用6ml冲洗），10000 rpm离心15 min，取上清液定容至10ml后于4℃保存。上清液用于可溶性蛋白质含量、SOD活性及POD活性的测定。
SOD活性测定
1.显反应 取5mL指形管（要求透明度好）4支，2支为测定管，另2支为对照管，按表47–1加入各溶液。 混匀后，给1支对照管照上比试管稍长的双层黑硬纸套遮光，与其他各管同时置于4000lx日光灯下反应20-30 min(要求各管照光情况一致，反应温度控制在25～35℃之间，使酶活性高低适当调整反应时间)。 当样品数量较大时，可在临用前根据用量将表47–1中各试剂(酶液和核黄素除外)按比例混合后一次加入2.65mL，然后依次加入核黄素和酶液，使终浓度不变。 表 47-1 各溶液显反应用量 试剂酶） | 用量(mL) | 终浓度(比时) | 0.05mol/L磷酸缓冲液 | 1.5 | | 130mmol/LMet溶液 | 0.3 | 13mmol/L | 750μmol/LNBT溶液 | 0.3 | 75μmol/L | 100μmol/L EDTA-Na2液 | 0.3 | 10μmol/L | 20μmol/L核黄素 | 0.3 | 2.0μmol/L | 酶液 | 0.1 | 2支对照管以缓冲液代替酶液 | 蒸馏水 | 0.5 | | 总体积 | 3.3 | | | | |
3.SOD活性测定 至反应结束后，用黑布罩盖上试管，终止反应。以遮光的对照管作为空白，分别在560nm下测定各管的OD值，计算SOD活性。 |
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3.<结果计算>
已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示，按下式计算SOD活性。 SOD总活性[u/g(FW)]= 式中：SOD总活性以酶单位每克鲜重表示。 比活力单位以酶单位每毫克蛋白表示。 ACK ——照光对照管的吸光度。 AE ——样品管的吸光度。 VT ——样品液总体积，mL。 V1 ——测定时样品用量，mL。 W——样品鲜重，g。 蛋白质含量单位为mg/g。 |
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愈创木酚法测定过氧化物酶（POD）活性
1.取两支试管，洗涤后甩干水分。
试剂 | 管号（对照） | 测定管 |
0.05mol/L PH 5.5的磷酸缓冲液 | 2.9ml | 2.9 ml |
2%双氧水溶液 | 0 ml | 1.0 ml |
0.05mol/L愈创木酚溶液（0.62g 95%的乙醇配制定容至100ml） | 1.0 ml | 1.0 ml |
蒸馏水 | 3.0 ml | 香皂包装2.0 ml |
总体积 | 7.0 ml | 7.0 ml |
| | |
将上述各管立即放入预先调好37 ℃的水浴锅中保温5min以上（酶促反应），向对照管中加入0.1 ml酶液，混匀，在λ470 nm处调零，再向测定管中加入0.1 ml酶液，并且立即计时，混匀后进行比测定，3分钟时立即读取吸光度。（也可以每分钟读取一次，3分钟内吸光度变化值ΔA ）
2.结果计算
以每分钟吸光度变化值表示酶活性大小，即以 ΔA 470 /[min · g （鲜重） ] 表示之。也可以用每 min 内 A 470 变化 0.01 为 1 个过氧化物酶活性单位（ u ）表示。
按下式计算酶的相对活性
△A470 × 酶提取液总量（ml）
酶活性（△A470·g－1Fw·min－1）= ———————————————————
样品鲜重（g）× 测定时酶液用量（ml）
过氧化氢酶的活性测定——紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶1个；0.5ml刻度吸管2支，2ml刻度吸管1支；10ml试管3支；恒温水浴；
【试剂】
0.2mol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1%聚乙烯吡咯烷酮）；
竖流沉淀池0.1mol/L H2O2（用0.1mol/L高锰酸钾标定）。
抗干扰滤波器【方法】
1.酶液提取：称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0.5g置研钵中，加入2～3ml 4℃下预冷
的pH7.0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入25ml容量瓶中，并用缓冲液冲洗研钵数次，合并冲洗液，并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min，取上部澄清液在4000rpm下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定：取10ml试管3支，其中2支为样品测定管，1支为空白管，按表40-2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 | S1 | S2 | S3 |
粗酶液(ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 |
pH7.8磷酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
| | 滤菌器 | |
25pvc覆膜胶水℃预热后,逐管加入0.3ml 0.1mol/L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比杯中，240nm下测定吸光度，每隔1min读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
3.结果计算：
以1min内A240减少0.1的酶量为1个酶活单位（u）。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240 = AS0－
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值；
AS1, AS2—样品管吸光值；
Vt—粗酶提取液总体积（ml）；
V1—测定用粗酶液体积（ml）；
FW—样品鲜重（g）；
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位（u）；
t—加过氧化氢到最后一次读数时间（min）。
【注意事项】 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。红外感应水龙头
叶绿素测定
一、原理
根据叶绿体素提取液对可见光谱的吸收，利用分光光度计在某一特定波长测定其吸光度，即可用公式计算出提取液中各素的含量。根据朗伯—比尔定律，某有溶液的吸光度A与其中溶质浓度C和液层厚度L成正比，即A＝αCL式中：α比例常数。当溶液浓度以百分浓度为单位，液层厚度为1cm时，α为该物质的吸光系数。各种有物质溶液在不同波长下的吸光系数可通过测定已知浓度的纯物质在不同波长下的吸光度而求得。如果溶液中有数种吸光物质，则此混合液在某一波长下的总吸光度等于各组分在相应波长下吸光度的总和。这就是吸光度的加和性。今欲测定叶绿体素混合提取液中叶绿素a、b和类胡萝卜素的含量，只需测定该提取液在三个特定波长下的吸光度A，并根据叶绿素a、b及类胡萝卜素在该波长下的吸光系数即可求出其浓度。在测定叶绿素a、b时为了排除类胡萝卜素的干扰，所用单光的波长选择叶绿素在红光区的最大吸收峰。
二、材料、仪器设备及试剂
（一）材料：新鲜（或烘干）的植物叶片。
（二）仪器设备：1. 分光光度计；2. 电子顶载天平（感量0.01g）；3. 研钵；4. 棕容量瓶；5. 小漏斗；6. 定量滤纸；7. 吸水纸；8. 擦境纸；9. 滴管。
（三）试剂：96％乙醇（或80％丙酮）；石英砂；碳酸钙粉。
三、实验步骤
1. 取新鲜植物叶片（或其它绿组织）或干材料，擦净组织表面污物，剪碎（去掉中脉），混匀。2. 称取剪碎的新鲜样品0.2g，共3份，分别放入研钵中，加少量石英砂和碳酸钙粉及2～3ml95％乙醇，研成均浆，再加乙醇10ml，继续研磨至组织变白。静置3～5min。3. 取滤纸1张，置漏斗中，用乙醇湿润，沿玻棒把提取液倒入漏斗中，过滤到25ml棕容量瓶中，用少量乙醇冲洗研钵、研棒及残渣数次，最后连同残渣一起倒入漏斗中。4. 用滴管吸取乙醇，将滤纸上的叶绿体素全部洗入容量瓶中。直至滤纸和残渣中无绿为止。最后用乙醇定容至25ml，摇匀。5. 把叶绿体素提取液倒入光径1cm的比杯内。以95％乙醇为空白，在波长665nm、649nm下测定吸光度。
四、实验结果计算：将测定得到的吸光值代入下面的式子：Ca=13.95A665－6.88A649；
Cb=24.96A649－7.32A665。据此即可得到叶绿素a和叶绿素b的浓度（Ca、Cb：mg/L），二者之和为总叶绿素的浓度。最后根据下式可进一步求出植物组织中叶绿素的含量：
叶绿素的含量（mg/g）= [叶绿素的浓度×提取液体积×稀释倍数]/样品鲜重（或干重）。
丙二醛采用硫代酸法测定
1、 MDA提取：称2g叶片，加入5ml磷酸缓冲液（50mmol PH值为7.8）以及少量石英砂，于冰浴中研磨提取，匀浆液以12000g离心力作用下（4度）离心10min，其上清液即MDA提取液。
2、 MDA测定：取1mlMDA提取液，加3ml 27%三和1ml 2%TBA。混合液在95度水浴中保温30min后，立即置于冰浴中冷却然后离心10min，于波长532nm和600nm下测定OD值。
结果计算
以测得的OD532减去OD600的非特异吸收值，按155m/molcm消光系数计算MDA含量。分别计算衰老和对照组的值。
MDA浓度（umol/L）=6.45（D532—D600）--0.56D450
MDA含量（umol/g FW）=MDA浓度（umol/L）*提取液体积（ml）/植物组织鲜重（g）
D450、D532、D600分别代表450nm、532nm和600nm波长下的光密度值。
注意事项
1、01—0.5%三对MDA—TBA反应比较合适，若高于此浓度其反应液的非专一性吸收偏高。
2、MDA—TBA显反应的加热时间最好控制沸水浴10—15min之间，时间短或者长均会引起532nm下的光吸收值下降。
3、如待测液浑浊，可适当增加离心力及时间，最好使用低温离心机。
4、低浓度的铁离子能增强MDA与TBA的显反应，当植物组织中铁离子浓度过低时应补充Fe3+(最终浓度为0.5nmol/L)。
5、可溶性糖与TBA显反应的产物在532nm也有吸收（最大吸收在450nm），当植物处于干旱、高温、低温等逆境时可溶性糖含量会增高，必要时要排除可溶性糖的干扰。
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