植物抗氧化酶包括超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、过氧化物酶（POD）等。它们普遍存在于植物的各种组织中，可以通过催化植物体内的活性氧，防止发生氧化反应。所以抗氧化酶活性与植物的代谢强度及逆境适应能力有密切关系，经常被用来衡量植物的抗性强弱和衰老程度。 一、 超氧化物岐化酶活性测定
超氧物歧化酶（SOD）普遍存在于动、植物体内，是一种清除超氧阴离子自由基（）的酶，它催化下列反应：
2
反应产物H2O2可被过氧化氢酶进一步分解或被过氧化物酶利用。因此SOD有保护生物体免受活性氧伤害的能力。已知此酶活力与植物抗逆性及衰老有密切关系，故成为植物逆境生理学的重要研究对象。
【原理】
琥珀酸二辛酯磺酸钠本实验依据超氧物歧化酶抑制氮蓝四唑（NBT）在光下的还原作用来确定酶活性大小。
在有可氧化物质存在下，核黄素可被光还原，被还原的核黄素在有氧条件下极易再氧化而产生，可将氮蓝四唑还原为蓝的甲。后者在560nm处有最大吸收，而SOD可清除从而抑制了甲的形成。于是光还原反应后，反应液蓝愈深，说明酶活性愈低，反之酶活性愈高。一个酶活性单位定义为将NBT除冰车的还原抑制到对照一半（50％）时所需的酶量，据此可以计算出酶活性大小。
【仪器与用具】
高速台式离心机；分光光度计；微量进样器；荧光灯（反应试管处光照强度为4000lx）；试管数支；黑硬纸套。
【试剂】
1．50mmol/L磷酸缓冲液（pH7.8）。
2．提取介质50mmol/L pH7.8磷酸缓冲液（内含1％聚乙烯吡咯烷酮）。
3．130mmol/L甲硫氨酸（Met）溶液：称取1.939 9g Met用磷酸缓冲液定容至100ml。
4．750μmol/L氮蓝四唑（NBT）溶液：称取61.33mg NBT用磷酸缓冲液定容至100ml，现配先用，避光保存。
5．100μmol/L EDTA-Na2溶液：取37.21mg EDTA-Na2用磷酸缓冲液定容至1 000ml。
6．20三维激光扫描技术μmol/L核黄素溶液：取7.53mg核黄素定容至1 000ml避光保存。
【材料与方法】
1．酶液提取：取一定部位的植物叶片（视需要定，去叶脉）0.5g于预冷的研钵中，加1ml磷酸缓冲液在冰浴下研磨成浆，倒入5ml离心管中，用提取介质冲洗研钵2～3次，最后加缓冲液使终体积为5ml。于10 000r/min下离心10min，上清液即为SOD粗提液。
2．显反应：取试管（要求透明度好）7支，3支为样品测定管，3支为对照管，另外1支作为空白，按表1加入各溶液。
混匀后将空白管置暗处，其他各管于4000lx日光灯下反应20min（要求各管受光情况一致，反应室的温度高时时间可适当缩短，温度低时时间可适当延长；温度范围30-37度）。
【结果处理】
SOD活性测定与计算 至反应结束后，以不照光的作空白，分别测定其他各管560nm波长下的吸光度值，已知SOD活性单位以抑制NBT光化还原的50%为一个酶活性单位表示。按下式计算SOD活性：
SOD总活性（U·g-1FW）=
式中 SOD总活性以每克鲜重酶单位表示；
A0—照光对照管的吸光度值；
AS—样品管的吸光度值；
VT—样液总体积（ml）；
V1—测定时样品用量（ml）；
FW—样重（g）；
表1-1 各溶液加入量
| 束腹带 试 剂（酶） | 测定管用量(ml) | 空白和对照管用量（ml） |
0.05mol/L磷酸缓冲液 130mmol/L Met溶液 750μmol/L NBT溶液 100μmol/L EDTA-Na2液 20μmol/L核黄素 酶液 蒸馏水 总体积 | 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 0.05 0.25 3.0 | 1.5 0.3 0.3 0.3 0.3 加缓冲液0.05 0.25 3.0 |
| | |
【注意事项】
1. 显反应过程中要随时观察光下对照管的颜变化，当A0达到0.6-0.8时终止反应。
2. 当光下对照管反应颜达到要求的程度时，测定管（加酶液）未显或颜过淡，说明酶对NBT的光还原抑制作用过强，应对酶液进行适当稀释后再显，以能抑制显反应的50%为最佳。
3. 植物组织中的酚类物质对测定干扰，对酚类含量高的材料提取酶液时刻加入聚乙烯吡咯烷酮（PVPP）消除之
【思考题】
1．在SOD测定中为什么设照光对照管和暗中空白管？
2．影响本实验准确性的主要因素是什么？应如何克服？
二、过氧化氢酶活性的测定（采用滴定法）
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收，过氧化氢酶能分解过氧化氢，使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低。根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计；离心机；研钵；250ml容量瓶；0.5ml刻度吸管；2ml刻度吸管；10ml试管；恒温水浴锅；
【试剂】
1. 0.2mol／L pH7.8磷酸缓冲液(内含1％聚乙烯吡咯烷酮)；
2. 0.l mol／L H2O2 ：市售30% H2O2 大约等于17.6mol/L，取30% H2O2 溶液5.68ml，稀释至1000ml。(用0.1mol／L高锰酸钾标定)。
【材料与方法】
1．酶液提取：称取剪碎的植物样品1.0g置研钵中，加入2~3ml 4℃下预冷的pH7.8磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后，转入10ml刻度试管中，并用缓冲液冲洗研钵2～3次，合
并冲洗液，并定容到刻度，摇匀。取部分提取液在4 000r/min下离心15min，上清液即为过氧化氢酶粗提液。
2．测定：取10ml试管4支，其中3支为样品测定管，1支为对照管，按表2顺序加入试剂。
表1-2 各溶液加入量
管 号 | S1 | S2大理石测量平台 | S3 | 企业私有云定制开发 S0对照 |
粗酶液(ml) | 0.2 | 0.2 | 0.2 | 0.2（煮死酶液） |
pH7.8磷酸(ml) | 1.5 | 1.5 | 1.5 | 1.5 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 1.0 | 1.0 | 1.0 |
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25℃预热后，逐管加入0.3ml 0.1mol／L的H2O2，每加完一管立即记时，并迅速倒入石英比杯中（可在比杯中直接加H2O2），240nm下测定吸光度(蒸馏水调零)，每隔lmin读数1次，共测4min，待3支管全部测定完后，按下式计算酶活性。
【结果处理】
以lmin内A240减少0.1为1个酶活单位(U)。
过氧化氢酶活性（U/gFW/min）=
式中Aso—加入煮死酶液的对照管吸光值；
Asl, As2, As3—样品管吸光度值；
Vt—粗酶提取液总体积(ml)；
V1—测定用粗酶液体积(ml)；
FW—样品鲜重(g)：
0.1—A240每下降0.1为1个酶活单位(u)：
t—加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
【注意事项】
1. 所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
2. 凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
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