过氧化物酶是植物体内普遍存在的、活性较高的一种酶,它与呼吸作用、光合作用及生长素的氧化等都有密切关系,在植物生长发育过程中,它的活性不断发生变化,因此测量这种酶,可以反映某一时期植物体内代谢的变化。 在有过氧化氢存在的条件下,过氧化物酶能使愈创木酚氧化,生成茶褐物质,该物质在 470 nm 处有最大吸收,可用分光光度计测量 470 nm 处的吸光度变化速率来测定过氧化物酶活性。 一、仪器、药品与材料
(一)实验材料
新鲜植物组织。
(二)仪器与用品
分光光度计,研钵,恒温水浴锅,100 mL 容量瓶,吸管,高速冷冻离心机,秒表,磁力搅
拌器。
(三)试剂
1.愈创木酚。
2.30%过氧化氢。
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3.100 mmol/L 磷酸缓冲液 pH 6.0。
4.反应混合液:取100 mmol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0)50 mL 于烧杯中,加入愈创木酚28 μL,于磁力搅拌器上加热搅拌,直至愈创木酚溶解,待溶液冷却后,加入 30 % 过氧化氢 19 μL,混合均匀,保存于冰箱中备用。
二、实验步骤
划线引小球
1.称取植物材料 0.1 g ,剪碎,放入研钵中,加入适量的磷酸缓冲液研磨成匀浆,残渣再用 5 mL 磷酸缓冲液提取一次,以 4000 rpm 低温离心 15 min ,上清液即为粗酶液,定容至10 mL刻度,贮于低温下备用。
碳纤维加热板2.取2支试管,于1只中加入反应混合液 3 mL 和磷酸缓冲液1mL,作为对照,另1支中加入反应混合液3 mL和上述酶液1mL(如酶活性过高可稀释之)。迅速将两支试管中溶液混匀后,倒入比杯,置于分光光度计样品室内,立即开启秒表记录时间,于470 nm 处测定吸光度(OD)值,每隔10S读数一次。
3.结果计算:以每分钟OD变化值(ΔA470 / gFW min)表示酶活性大小,。也可以用每min OD值变化0.01作为1个过氧化物酶活性单位(U)表示。
过氧化物酶活性(U/gFW·min)= ΔA470×VT/W×VS×0.01×t
式中:
线性排水沟尺寸ΔA470——反应时间内OD变化值。
VT——提取酶液总体积(mL)。
W ——植物鲜重(g)。
Vs——测定时取用酶液体积(mL)。
t ——反应时间(min)。
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