植物在逆境下或衰老时,由于体内活性氧代谢加强而使H2O2发生累积.H2O2可以直接或间接地氧化细胞内核酸,蛋白质等生物大分子,并使细胞膜遭受损害,从而加速细胞的衰老和解体。过氧化氢酶可以清除H2O2,是植物体内重要的酶促防御系统之一。因此,植物组织中H2O2含量和过氧化氢酶活性与植物的抗逆性密切相关。本实验用分光光度法测定过氧化氢含量,利用高锰酸钾滴定法和紫外吸收法测定过氧化氢酶活性. 一、过氧化氢含量的测定
【原理】
H2O2风暖加热器与硫酸钛(或氯化钛)生成过氧化物—钛复合物黄沉淀,可被H2SO4溶解后,在415nm波长下比测定.在一定范围内,其颜深浅与H2O2浓度呈线性关系.
【仪器和用具】
研钵;移液管0.2ml×2支,5ml×1支;容量瓶10ml×7个,离心管5ml×8支;离心机;分光光度计。
【试剂】
100μmol/L H2O2丙酮试剂:取30%分析纯H2O2 57μl,溶于100ml,再稀释100倍;2mol/L硫酸;5%(W/V)硫酸钛;丙酮;浓氨水.
【方法】
1。制作标准曲线:取10ml离心管7支,顺序编号,并按表40—1加入试剂. 表40-1 测定H2O2浓度标准曲线配置表
试剂(ml) | 离 心 管 号 |
1 | 2 | 3 | 4 | 5 | 6 | 7 |
100μmol/L H2O2 | 0 | 0.1 | 0.2 | 0。4 | 0。6 | 0。8 | 1.0 |
4℃下预冷丙酮 | 1。0 | 0.9 | 0.8 | 0.6 | 0.4 | 0。2 | 0 |
5%硫酸钛 | 0.1 | 0.1 | 0。1 | 0。1 | 0.1 | 视频显示器0.1 | 0。1 |
浓氨水 | 0.2USB重定向 | 0。2 | 0。2l型密封圈 | 0。2 | 0。2 | 0。2 | 0。2 |
| 3000r/min 离心10min,弃去上清夜,留沉淀 |
2mol 硫酸 | 5.0 | 5。0 | 5。0 | 5.0 | 5.0 | 5。0 | 分界开关控制器5.0 |
| | | | | | | |
待沉淀完全溶解后,将其小心转入10ml容量瓶中,并用蒸馏水少量多次冲洗离心管,将洗涤液合并后定容至10ml刻度,415nm波长下比.
2.样品提取和测定:(1)称取新鲜植物组织2~5g(视H2O2含量多少而定),按材料与提取剂1∶1的比例加入4℃下预冷的丙酮和少许石英砂研磨成匀浆后,转入离心管3000 r/min下离心10min,弃去残渣,上清液即为样品提取液。(2)用移液管吸取样品提取液1ml,按表35—1加入5%硫酸钛和浓氨水,待沉淀形成后3000rpm/min离心10min,弃去上清液。沉淀用丙酮反复洗涤3~5次,直到去除植物素。(3)向洗涤后的沉淀中加入2mol硫酸5ml,待完全溶解后,与标准曲线同样的方法定容并比。 3.结果计算:
植物组织中H2O2含量(μmol/g Fw)=
式中 C—标准曲线上查得样品中H2O2浓度(μmol);
Vt—样品提取液总体积(ml);
V1—测定时用样品提取液体积(ml);
FW-植物组织鲜重(g)。
二、过氧化氢酶的活性测定——高锰酸钾滴定法
【原理】
过氧化氢酶(CAT)属于血红蛋白酶,含有铁,它能催化过氧化氢分解为水和分子氧,在此过程中起传递电子的作用,过氧化氢则既是氧化剂又是还原剂。
R(Fe+2)+H2O2==R(Fe+3+OH-)
R(Fe+3OH-)2+H2O2==R(Fe+2)2+2H2O+O2
据此,可根据H2O2的消耗量或O2的生成量测定该酶活力大小。在反应系统中加入一定量(反应过量)的H2O2溶液,经酶促反应后,用标准高锰酸钾溶液(在酸性条件下)滴定多余的H2O2
5H2O2+2KMnO4+4H2SO4 5O2+2KHSO4+8H2O+2MnSO4
即可求出消耗的H2O2的量。
【仪器和用具】
研钵;三角瓶50ml×4;酸式滴定管(10ml);恒温水浴;容量瓶25ml×1。
【试剂】
10% H2SO4;0。2mol/L磷酸缓冲液pH7.8;
0。1mol/L高锰酸钾标准液:称取KMnO4(AR)3.1605g,用新煮沸冷却蒸馏水配制成1000ml,用0。1mol/L草酸溶液标定;
0.1mol/L H2O2:市售30% H2O2大约等于17。6mol/L,取30% H2O2溶液5。68ml,稀释至1000ml,用标准0。1mol/ KMnO4溶液(在酸性条件下)进行标定;
0。1mol/L草酸:称取优级纯H2C2O哺乳衫4·2H2O 12。607g,用蒸馏水溶解后,定容至1L。
【方法】
1。酶液提取 取小麦叶片2.5g加入pH7.8的磷酸缓冲溶液少量,研磨成匀浆,转移至25ml容量瓶中,用该缓冲液冲洗研钵,并将冲洗液转入容量瓶中,用同一缓冲液定容,4000rpm离心15min,上清液即为过氧化氢酶的粗提液。
2。取50ml三角瓶4个(两个测定两个对照),测定瓶中加入酶液2.5ml,对照瓶中加入煮死酶液2.5ml,再加入2。5ml 0。1mol/L H2O2,同时计时,于30℃恒温水浴中保温10min,立即加入10% H2SO4 2。5ml。
3。用0。1mol/L KMnO4标准溶液滴定H2O2,至出现粉红(在30min内不消失)为终点.
4.结果计算:
酶活性用每克鲜重样品1min内分解H2O2的毫克数表示:
酶活(mgH2O2/gFW·min)=
式中 A—对照KMnO4滴定毫升数;
B-酶反应后KMnO4滴定毫升数;
VT—酶液总量(ml);
V1—反应所用酶液量(ml);
W—样品鲜重(g);
1.7—1ml 0。1mol/L的KMnO4相当于1。7mg H2O2。
【注意】
所用KMnO4溶液及H2O2溶液临用前要经过重新标定。
三、过氧化氢酶的活性测定-—紫外吸收法
【原理】
H2O2在240nm波长下有强烈吸收,过氧化氢酶能分解过氧化氢,使反应溶液吸光度(A240)随反应时间而降低.根据测量吸光率的变化速度即可测出过氧化氢酶的活性。
【仪器与用具】
紫外分光光度计;离心机;研钵;250ml容量瓶1个;0。5ml刻度吸管2支,2ml刻度吸管1支;10ml试管3支;恒温水浴;
【试剂】
0。2mol/L pH7.8磷酸缓冲液(内含1%聚乙烯吡咯烷酮);
0.1mol/L H2O2(用0.1mol/L高锰酸钾标定)。
【方法】
1。酶液提取:称取新鲜小麦叶片或其它植物组织0。5g置研钵中,加入2~3ml 4℃下预
冷的pH7。0磷酸缓冲液和少量石英砂研磨成匀浆后,转入25ml容量瓶中,并用缓冲液冲洗研钵数次,合并冲洗液,并定容到刻度。混合均匀将量瓶置5℃冰箱中静置10min,取上部澄清液在4000rpm下离心15min,上清液即为过氧化氢酶粗提液。5℃下保存备用。
2.测定:取10ml试管3支,其中2支为样品测定管,1支为空白管,按表40—2顺序加入试剂。
表40-2 紫外吸收法测定H2O2样品液配置表
管 号 | S1 | S2 | S3 |
粗酶液(ml) | 0.2 | 0.2 | 0。2 |
pH7。8磷酸(ml) | 1。5 | 1.5 | 1。5 |
蒸馏水(ml) | 1.0 | 1。0 | 1.0 |
| | | |
25℃预热后,逐管加入0。3ml 0.1mol/L的H2O2,每加完一管立即记时,并迅速倒入石英比杯中,240nm下测定吸光度,每隔1min读数1次,共测4min,待3支管全部测定完后,按下式计算酶活性。
3.结果计算:
以1min内A240减少0。1的酶量为1个酶活单位(u)。
过氧化氢酶活性(u/gFW/min)=
式中 A240= AS0-
AS0—加入煮死酶液的对照管吸光值;
AS1, AS2—样品管吸光值;
Vt—粗酶提取液总体积(ml);
V1—测定用粗酶液体积(ml);
FW—样品鲜重(g);
0。1—A240每下降0。1为1个酶活单位(u);
t-加过氧化氢到最后一次读数时间(min)。
【注意事项】
凡在240nm下有强吸收的物质对本实验有干扰。
【思考题】
1.影响过氧化氢酶活性测定的因素有哪些?
2.过氧化氢酶与哪些生化过程有关?