一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒及其应用

1.本发明涉及生物检测技术领域，尤其是涉及一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒及其应用，应用于溶菌酶定量检测技术领域。

背景技术：

2.溶菌酶是一种分子量为14400da的蛋白质，其由129个氨基酸组成。由于溶菌酶具有抑菌性，在食品工业中作为防腐剂被广泛使用。然而，溶菌酶也是一种常见的过敏原，其是鸡蛋中的五种主要致敏蛋白之一，过敏会引起轻度荨麻疹及过敏性休克等症状，有大量儿童对蛋制品过敏。因此，目前需要方便快捷的检测手段对消费者的安全进行保护。
3.目前测定溶菌酶的含量有高效液相谱，酶联免疫吸附法等，这些方法往往需要昂贵的仪器，复杂的检测流程，较高的检测门槛，这些缺点无法满足现实生活中快速、高效、便捷检测溶菌酶的需求。侧向免疫层析法具有检测时间短，检测人员不需进行实验培训等优点，该技术具备应用于检测溶菌酶的潜力。但是，侧向免疫层析法的核心-天然抗体具有热稳定性差的缺点，易受环境温度变化而失活从而无法完成检测，在一定程度上限制了侧向免疫层析法的应用。因此，需要使用制备过程简单、热稳定性良好的天然抗体替代物，并且开发出基于这种抗体替代物的侧向免疫层析法。通过构象工程而设计出来的生物素化抗溶菌酶金抗体，具有良好的热稳定性，且能够特异性结合溶菌酶和链霉亲和素，具有作为天然抗体替代物应用于侧向免疫层析法的潜力。

技术实现要素：

4.为了解决现有技术问题，本发明的目的在于克服已有技术存在的不足，提供一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒及其应用，使用制备过程简单、热稳定性良好的生物素化抗溶菌酶金抗体，并且将其用于侧向免疫层析竞争法以检测鸡蛋清溶菌酶含量，具有检测时间短，操作简便等优点。
5.为达到上述目的，本发明采用如下技术方案：
6.一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒，包括生物素化抗溶菌酶金抗体、侧向免疫层析试纸、溶菌酶标准品和稀释液。
7.优选地，使用生物素化抗溶菌酶金抗体，以侧向免疫层析竞争法对溶菌酶进行检测，具体方法步骤为：
8.溶菌酶和链霉亲和素预先包被在检测试纸条的测试线和控制线区域，将待测样品与生物素化抗溶菌酶金抗体混合孵育后，将混合溶液滴加在检测试纸条的样品垫上，待反应结束后可以直接通过肉眼进行定性测试，同时拍照并分析检测限区域的颜强度，进而绘制标准曲线，确定待测溶菌酶样品浓度。
9.一种本发明检测溶菌酶免疫层析试剂盒的应用，用于实施检测溶菌酶的方法，将溶菌酶标准品使用稀释液稀释，然后按以下步骤开始检测，包括如下步骤：
10.(1)混合孵育：将100-500μl不同浓度的溶菌酶标准品与100-500μl生物素化抗溶
菌酶金抗体溶液混合，孵育5-30min；
11.(2)显：将50-200μl混合溶液滴加在检测试纸条的样品垫上，静置反应5-30min；
12.(3)检测分析:定性测试结果可以直接用肉眼判断，测试线不显即为阳性，定量测试是将试纸条拍照后识别测试线区域的颜强度(t)，空白样品的颜强度为t0，从而得到不同浓度溶菌酶标准品对应的t/t0，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为t/t0，绘制检测溶菌酶的标准曲线。
13.优选地，稀释液为ph为9-11的缓冲溶液。
14.优选地，溶菌酶包被在硝酸纤维素膜的测试线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml，喷膜量为0.5-1.5μl/cm。
15.优选地，链霉亲和素包被在硝酸纤维素膜的控制线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml，0.5-1.5μl/cm。
16.本发明与现有技术相比较，具有如下显而易见的突出实质性特点和显著优点：
17.1.本发明检测溶菌酶的免疫层析试剂盒使用金抗体代替天然抗体用于检测，可以解决天然抗体热稳定性差的缺点，金抗体即使在高温处理后，仍可以准确定量待测样品中的溶菌酶含量；
18.2.本发明采用侧向免疫层析法中的竞争法原理，可以定量检测鸡蛋清中的溶菌酶；本发明试剂盒使用金抗体作为天然抗体的替代物进行检测，解决了天然抗体热稳定性差等缺点，且兼具侧向免疫层析试剂盒的其他优点。
附图说明
19.图1为本发明优选实施例检测溶菌酶的原理示意图。
20.图2为本发明优选实施例检测溶菌酶的标准曲线。
具体实施方式
21.下面将结合本发明实施例中的附图，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
22.本发明优选实施例使用了公开号为cn105884888a的专利文献公开的，根据cab-lys3的cdr3的多肽片段设计的pep1，通过s-au键嫁接到金纳米粒子上，制备出与天然抗体相同特异性的抗溶菌酶金抗体。在此基础上，使用了生物素化抗溶菌酶金抗体，将巯基聚乙二醇巯基，标记了巯基聚乙二醇的生物素以及多肽先后投加到金纳米粒子溶液中，从而合成出生物素化抗溶菌酶金抗体。
23.本发明优选实施例使用上述生物素化抗溶菌酶金抗体，按照侧向免疫层析法中的竞争法原理对溶菌酶进行检测。如图1所示，其检测原理为：溶菌酶和链霉亲和素分别预先包被在检测试纸条的测试线和控制线区域，如图1a所示，当待测样品为阴性时，当待测样品为阴性时，生物素化抗溶菌酶金抗体与包被在测试线上的溶菌酶结合，从而测试线显红，如图1b所示；当待测样品为阳性时，待测样品中的溶菌酶在孵育时与金抗体结合，进而与测试线结合的金抗体减少，从而测试线的红减弱或不显，如图1c所示，定性检测可以通过
肉眼判断测试线是否显，测试线上的颜强度与溶菌酶的浓度呈负相关，由此可以绘制出一条标准曲线，从而进行定量检测。
24.本发明试剂盒，它包括：生物素化抗溶菌酶金抗体、侧向免疫层析试纸、溶菌酶标准品、稀释液。
25.本发明进行检测溶菌酶的步骤如下:
26.(1)混合孵育：将100-500μl不同浓度的溶菌酶标准品与100-500μl生物素化抗溶菌酶金抗体溶液混合，孵育5-30min；
27.(2)显：将50-200μl混合溶液滴加在检测试纸条的样品垫上，静置反应5-30 min；
28.(3)检测分析:定性测试结果可以直接用肉眼判断，测试线不显即为阳性，定量测试是将试纸条拍照后识别测试线区域的颜强度(t)，空白样品的颜强度为t0，从而得到不同浓度溶菌酶标准品对应的t/t0，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为t/t0，绘制检测溶菌酶的标准曲线。
29.本发明优选实施例所述稀释液为ph 9-11的缓冲溶液,溶菌酶包被在硝酸纤维素膜的测试线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml，链霉亲和素包被在硝酸纤维素膜的控制线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml。
30.为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面结合附图和具体实施方式对本发明作进一步详细的说明。
31.以下结合具体的实施例子对上述方案做进一步说明，本发明的优选实施例详述如下：
32.实施例一：
33.在本实施例中，侧向免疫层析试纸的构建，方法如下：
34.在试纸条进行组装之前，需要对试纸条的样品垫进行预处理。使用ph7.4的磷酸盐缓冲液(0.5％bsa以及1％tween-20)作为与处理液，将裁切至合适大小的样品垫在处理液中浸泡4h，浸泡完成后在37℃下烘干。
35.使用划膜喷金仪以1μl/cm将溶菌酶和链霉亲和素分别包被于硝酸纤维素膜的测试线和控制线，包被完成后在37℃下烘干。在pvc底板上完成试纸条的组装，将硝酸纤维素膜、样品垫、吸水纸依次放置在底板上。组装完成后将其裁切至宽度为4mm的试纸条。
36.实施例二：
37.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
38.在本实施例中，绘制溶菌酶标准曲线，方法如下：
39.将溶菌酶标准品使用稀释液稀释，稀释液采用20mmph9.2碳酸盐缓冲溶液，最终浓度为1000，500，250，125，62.5，31.25，15.63，0ng/ml，然后按以下步骤开始检测：
40.(1)混合孵育：将400μl不同浓度的溶菌酶标准品与100μl生物素化抗溶菌酶金抗体溶液混合，孵育5min；
41.(2)显：将100μl混合溶液滴加在检测试纸条的样品垫上，静置反应10min；
42.(3)检测分析:定性测试结果可以直接用肉眼判断，测试线不显即为阳性，定量测试是将试纸条拍照后识别测试线区域的颜强度(t)，空白样品的颜强度为t0，从而得到不同浓度溶菌酶标准品对应的t/t0，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为t/t0，绘制检测溶菌酶的
标准曲线，图2即为得到的检测溶菌酶标准曲线。
43.实施例三：
44.本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
45.在本实施例中，使用不同温度预处理后的生物素化抗溶菌酶金抗体进行加标测试，方法如下：
46.为了探究金抗体的热稳定性，将1ml金抗体溶液分别置于60℃、80℃和100℃的水浴中进行预处理1h，待三个样品冷却至室温后备用。将加标样品浓度设置为125ng/ml，按照实施例3使用在不同温度下预处理后的金抗体进行测试。每个样品平行测试三次，计算t/t0并代入标准曲线中得到测试值，进而计算回收率。表1为检测结果，即使在100℃处理后，使用生物素化抗溶菌酶金抗体仍可以准确地定量加标样品的浓度，整体回收率均在90％-110％以内，符合检测标准。
47.表1.使用不同温度处理后的金抗体进行加标测试结果
[0048][0049]
实施例四：
[0050]
本实施例与前述实施例基本相同，特别之处在于：
[0051]
在本实施例中，检测鸡蛋清中的溶菌酶，方法如下：
[0052]
人工分离新鲜鸡蛋中的蛋清，使用20mmph9.2碳酸盐缓冲液将蛋清稀释至检测范围内，并按照实施例3对稀释后的样品进行检测，检测所得的t/t0代入标准曲线即可得到检测值，检测值与稀释倍数的乘积为蛋清中溶菌酶的含量。本实施例分别对三个鸡蛋的蛋清进行检测，得到了三个鸡蛋分别的溶菌酶含量。
[0053]
表2.检测鸡蛋清中溶菌酶含量的结果
[0054][0055]
上述实施例生物素化抗溶菌酶金抗体及检测溶菌酶侧向免疫层析试剂盒及其应用。该侧向免疫层析试剂盒包括：生物素化抗溶菌酶金抗体、侧向免疫层析试纸、溶菌酶标准品和稀释液。本发明还公开了使用该试剂盒检测样品的方法。上述实施例试剂盒采用侧向免疫层析法中的竞争法原理，可以定量检测鸡蛋清中的溶菌酶。上述实施例试剂盒使用生物素化抗溶菌酶金抗体作为天然抗体的替代物，既降低了生产成本，也解决了天然抗体热稳定性差等缺点，且兼具侧向免疫层析试剂盒的其他优点。
[0056]
上面结合附图对本发明实施例进行了说明，但本发明不限于上述实施例，还可以
根据本发明的发明创造的目的做出多种变化，凡依据本发明技术方案的精神实质和原理下做的改变、修饰、替代、组合或简化，均应为等效的置换方式，只要符合本发明的发明目的，只要不背离本发明的技术原理和发明构思，都属于本发明的保护范围。

技术特征：

1.一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒，其特征在于：包括生物素化抗溶菌酶金抗体、溶菌酶标准品、稀释液、侧向免疫层析试纸。2.根据权利要求1所述检测溶菌酶免疫层析试剂盒，其特征在于：使用生物素化抗溶菌酶金抗体，以侧向免疫层析法的竞争法原理对溶菌酶进行检测，具体方法步骤为：溶菌酶和链霉亲和素预先包被在侧向免疫层析试纸的测试线和控制线区域，将待测样品与生物素化抗溶菌酶金抗体混合孵育后，将混合溶液滴加在试纸的样品垫上，待反应结束后拍照并分析检测限区域的颜强度，进而绘制标准曲线，确定待测溶菌酶样品浓度。3.一种权利要求1所述检测溶菌酶免疫层析试剂盒的应用，用于实施检测溶菌酶的方法，其特征在于：将溶菌酶标准品使用稀释液稀释，然后按以下步骤开始检测，包括如下步骤：(1)混合孵育：将100-500μl不同浓度的溶菌酶标准品与100-500μl生物素化抗溶菌酶金抗体溶液混合，孵育5-30min；(2)显：将50-200μl混合溶液滴加在试纸的样品垫上，静置反应5-30min；(3)检测分析:定性测试的结果可以直接用肉眼判断，测试线不显即为阳性，定量测试是将试纸条拍照后识别测试线区域的颜强度(t)，空白样品的颜强度为t0，从而得到不同浓度溶菌酶标准品对应的t/t0，以x轴为溶菌酶浓度，y轴为t/t0，绘制检测溶菌酶的标准曲线。4.根据权利要求3所述检测溶菌酶免疫层析试剂盒的应用，其特征在于：溶菌酶包被在硝酸纤维素膜的测试线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml，喷膜量为0.5-1.5μl/cm。5.根据权利要求3所述检测溶菌酶免疫层析试剂盒的应用，其特征在于：链霉亲和素包被在硝酸纤维素膜的控制线区域，包被浓度为0.5-1.5mg/ml，0.5-1.5μl/cm。6.根据权利要求3所述检测溶菌酶免疫层析试剂盒的应用，其特征在于：稀释液为ph为9-11的缓冲溶液。

技术总结

本发明公开了一种基于金抗体的检测溶菌酶免疫层析试剂盒及其应用。该免疫层析试剂盒包括：生物素化抗溶菌酶金抗体、侧向免疫层析试纸、溶菌酶标准品和稀释液。本发明还公开了使用该试剂盒检测样品的方法。上述实施例试剂盒采用侧向免疫层析法中的竞争法原理，可以定量检测鸡蛋清中的溶菌酶。上述实施例试剂盒使用生物素化抗溶菌酶金抗体作为天然抗体的替代物，既降低了生产成本，也解决了天然抗体热稳定性差等缺点，且兼具侧向免疫层析试剂盒的其他优点。其他优点。其他优点。