简 报 第46卷 第19期 2001年10月
1641
Fiber-FISH 测定
李宗芸 黄思罗 金危危 宁顺斌 宋运淳* 李立家
(武汉大学植物发育生物学教育部重点实验室, 武汉 430072. *
联系人, E-mail: ycsong@)
摘要 用伸展DNA 纤维的荧光原位杂交(Fiber-FISH)技术测定了5S rDNA 和着丝粒DNA 顺序RCS2在水稻广陆矮四号(Oryza sativa ssp indica cv Guangluai No4)基因组中的拷贝数. 为了确定拷贝数, 需要知道显微镜下一定长度DNA 纤维所含碱基对数. 为此, 测量了两个已知碱基对数DNA 序列的伸展纤维在显微镜下的长度. 其中供试BAC38D17的插入序列为136 kb, 其伸展纤维在显微镜下的长度为56.4 µm , 平均为2.41 kb/µm; BAC44B4全长为144.5 kb, 其伸展纤维的长度为55.7 µm, 平均为2.60 kb/µm . 这与Watson-Crick 模型中B-DNA 的2.97 kb/µm 十分接近. 根据两个样本每微米平均碱基数, 即2.51 kb/µm 的标准, 计算出5S rDNA 的拷贝数约为686, 着丝粒DNA 顺序RCS2约为286 ÎïÀíͼÆ×¹¹½¨
5].
1996年, Fransz 等人[6]首先将这一技术引入植物拟南芥和番茄的小重复序列和cosmid 连接(contig)研究, 之后人们在水稻
载人行李箱小麦
） 植物材料. 水稻品种“广陆矮四号”(Oryza ,
sativa ssp indica cv Guangluai No4)由中国科学院国家基因研究中心提供. (汽车电子防盗锁
) 提取细胞核. 提取细胞核按Liu 和
Whittier [15]的方法稍加改进. 取2
3次混
匀, 冰上轻摇(小于100 r/min) 5 min, 将此溶液依次通过单层纱布, 48和30 ìm 的尼龙膜过滤. 在滤液中加入1 mL 含10%(体积比)Triton-100的核提取液, 以除去线粒体和叶绿体, 4
下备用.
(
第46卷 第19期 2001年10月
简 报
1642
加入到100 ìL 核提取液中混匀, 3000
5 min, 然后加8 ìL STE 核裂解液
(0.5% SDS, 5 mmol/L EDTA, 10 mmol/L Tris, pH 7.0), 室温下处理4 min 以裂解细胞核. 用干净盖玻片倾斜45
下烘干30
min, 选样片YoYo 染, 在荧光显微镜下检查DNA 纤维的质量. 制片可马上用于杂交, 亦可贮于−20
) 探针标记. 水稻着丝粒探针pRCS2(629 bp,
包含4个168 bp 的RCS2)由美国Wisconsin 大学Jiang Jiming 教授提供, BAC38D17, 44B4由武汉大学遗传研究所傅彬英博士提供. 所有探针均用切刻平移法标记, 5S rDNA 和BAC38D17, 44B4用生物素-11- dUTP(Sigma)标记, 着丝粒探针pRCS2分别用生物素- 11-dUTP 和-11-dUTP(Boehringer Mannheim Biochemica)标记.
(
SSC, 50
40 ng 探针DNA. 将杂交混合液加到制片上, 盖22 mm 共变性3 min, 于保湿
盒中37
48 h. 杂交后的清洗为2
, 10 m in.
(
SSC, 0.05% Tween20)洗
制片
链路层劫持
５％ ｄｒｉｅｄ ｎｏｎｆａｔ ｍｉｌｋ，
Ｓｉｇｍａ， ４ ＳＳＣ， ｐＨ ７．０）５０
下温育30 min, 然后用4 T 缓冲液洗制片2 min. 生物素和标记的探针分别经过羊抗生物素-FITC 偶联物(goat anti-biotin FITC conjugate), 兔抗羊-生物素偶联物(rabbit anti-goat
biotin conjugate (Sigma)), 羊抗生物素-FITC 偶联 物(goat anti-biotin FITC conjugate (Sigma))或鼠抗 (mouse anti-digoxigenin), 羊抗鼠-偶 联物(sheep anti-mouse Ig-digoxigenin), 羊抗地高 辛-罗丹明偶联物(sheep anti-digoxigenin-rhodamine (Boehringer Mannheim Biochemica))的三重检测和信号放大. (
,6-diamidino-2-phenylindole)复染, DNA 伸展
纤维制片加抗淬灭剂Vectorshield(Vector Lab), 用Olympus BX60显微镜观察荧光原位杂交信号, Photometrics SenSys CCD (charge coupled device) 1400E 照相装置俘获图像, V ++ Precision Digital Imaging System 和Photoshop 软件进行测量和图像 处理.
2 结果与讨论
在伸展的水稻核DNA 制片上, 以BAC 克隆38D17为探针, 杂交信号为伸展的念珠状长链(图版
中2). 无论是对于动物还是植物, 在不同的Fiber-FISH 研究中, 杂交信号均表现为非连续的念珠状, 其原因目前尚不完全清楚. Van De Rijke 等人[17]认为, 两念珠之间的间隙是由于DNA 变性过程中靶DNA 部分丢失的结果. 此外, 他们还提出, 在杂交过程中探针DNA 片段与靶DNA 是随机相遇并进行结
合的, 靶DNA 有的区域得到了充分的结合, 另一些区域则很少或没有结合. 因此, 念珠的大小是不一致的, 念珠之间的间隙区域就是没有得到结合的部分. 显然这些解释还有待于进一步验证. 不管形成念珠状信号的原因如何, 毫无疑问, 它们所代表的是Fiber-FISH 的真实结果, 所反映的是供试的伸展靶DNA 顺序. 相反, 在显微镜下有时可见到连续的与念珠信号颜相同的线条, 这些线条光滑, 不同部位
的大小和亮度几乎没有差别, 不可能由DNA 杂交形成, 多半是荧光染料污染的结果. 所以, 鉴定Fiber-FISH 成功与否, 或杂交信号是否真实, 信号是否连续, 形状如何是关键的标准.
BAC 克隆38D17探针的杂交信号所代表的仅仅是其中插入DNA 顺序的同源区, 因为载体部分与水稻核DNA 是非同源的. 椭圆形的念珠状信号则是代
表整个BAC 克隆44B4的DNA 链形态. BAC DNA 链的形状在光学显微镜下是不可分辨的, 通过杂交和
标记放大变成可分辨的了. BAC38D17杂交信号的长
简 报 第46卷 第19期 2001年10月
1643
度平均为(56.3612]; 而且, 在已知碱基数的对照研究中, 不同的检出DNA 纤维长度比较一致, 这表明我们所用的技术相对稳定, 可以使DNA 纤维较充分地伸展, 且在一定的长度范围内不会或很少引起DNA 断裂, 这就为数量DNA 纤维作图提供了可靠的保证. 显然, Fiber-FISH 技术在物理作图中的应用是十分有效的.
5S rDNA 在伸展的水稻核DNA 制片上的杂交信号见图版
中
５), 与报道的栽培稻只有单一座位[13,18,19]相符. 这也印证了Fiber-FISH 所表明的结果, 即被杂交的不同纤维信号长度基本一致.
着丝粒顺序RCS2对核DNA 杂交结果表明, 绿念珠信号链长度为19ÖÐ4), 相当
于48
1121. 着丝粒顺序RCS2的杂交在每
一染体着丝粒区域均显出了红的信号, 但信号的强弱在不同染体上具有较大的差异; 其中一对染体上信号微弱到几乎难以记录下来, 一对染体的信号大而特别明亮, 其余染体的信号大小和亮度都介于其间(图版
２３０像素. 这和我
们用伸展纤维杂交测定的拷贝数变幅 3.9倍相去不
远. RCS2杂交信号最弱的可能是第2染体, 最强的可能是第1染体. 由于每一染体的着丝粒区域均有信号, 而在染体着丝粒以外的区域没有发现信号, 说明这一顺序仅为着丝粒区域所特有, 是这一区域的有效标记.
致谢 感谢美国Wisconsin 大学Jiang Jiming 教授帮助作者建立了Fiber-FISH 实验体系, 并提供着丝粒探针和个人相关研究资料, 感谢美国Iowa 大学H. H. Heng 教授，荷兰Wangeningen 农业大学J. Hans
de Jong 教授提供个人相关研究资料. 本工作为国家自然科学基金(批准号: 39900083)和教育部高等学校博士学科点专项科研基金(批准号: 97048607)资助项目.
参 考 文 献
1
Henry H Q H, Squire J, Tsui L C. High-resolution mapping of
mammalian genes by in situ hybridization to free chromatin. Proc Natl Acad Sci USA, 1992, 89: 9509
591
3
Parra I, Windle B. High resolution visual mapping of stretched DNA by fluorescence hybridization. Nature Genet, 1993, 5: 17
塑料口罩
40
5
Suto Y, Ishikawa Y, Hyodo H, et al. Gene organization and rearrangements at the human Rhesus blood group locus revealed by fiber-FISH analysis. Hum Genet, 2000, 106(2): 164
430
7跳跳鞋
de Jong J H, Fransz P F, Zabel P. High resolution FISH in plants techniques and applications. Trend in Plant Science, 1999, 4(7): 258
517
9
Mesbah M, Wennekes -Van Eden J, de Jong J H, et al. FISH to mitotic chromosomes and extended DNA fibres of Beta procumbens in a series of monosomic addition to beet (B.vulgaris ). Chromosome Research, 2000, 8: 285149
11 Dong F, Miller J T, Jackson S A, et al. Rice (O ryza sative )
centromeric regions consist of complex DNA. Proc Natl Acad Sci USA, 1998, 95: 8135
第46卷 第19期 2001年10月
简 报
1644
concurrent changes in different DNA families in indica and japonica rice. Mol Gen Genet, 2000, 263: 388
661
14 Jackson S A, Dong F, Jiang J. Digital mapping of bacterial
artificial chromosome by fluorescence in situ hybridization. The
Plant J, 1999, 17(5): 581
2169
16 Song Y C, Gustafson J P. Physical location of fourteen RFLP
cn-m
markers in rice (Oryza sativa L). Theor Appl Genet, 1995, 90:
113
745
18 Shishido R, Sano Y, Fukui K. Ribosomal DNAs: an exception to
the conservation of gene order in rice genomes. Mol Gen Genet,
2000, 263: 586
138
(2001-04-19收稿, 2001-07-19收修改稿)
李宗芸等： 水稻5S rDNA和着丝粒顺序RCS2拷贝数的Fiber-FISH测定图版
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议