一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法

1.本发明属于茶多糖提取技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法。

背景技术：

2.湖北青砖茶(hubei chin brick tea)属于黑茶，其主产于于鄂南、湘北等地区。距今已有六百多年的生产历史。原料是海拔600-1200米高山茶树鲜叶，经压制而成。研究表明其在降脂、减肥、抗氧化等方面有显著的活性功效。茶多糖(tea polysaccharide)是茶叶中提取的一类具有生理活性的糖复合物，其有抗癌、降低血糖、增强免疫功能、抗氧化、抗菌等生理功能，其降血糖作用成为社会广泛关注的焦点，作为青砖茶主要功能活性成分之一的茶多糖更是受到了广泛的关注，目前已知茶多糖可作为一种糖尿病及心血管疾病的保健品或药物，是具有广大开发前景的纯天然药物。
3.目前我国对茶多糖的提取方法主要有水、酸溶液和稀碱溶液，酸液或碱液可以破坏植物细胞壁，是多糖在提取过程中更加容易溶出，提高提取率，但是此方法可能造成果糖的糖苷键断裂及构象发生变化，使茶多糖失去活性；热水浸提法能够保证茶多糖的结构和生物活性不被破坏，且操作简单，但是提取率在2％-3％左右，因此只能通过增加浸提次数来进行弥补，但是这种方法耗时多且提取率的增加程度有限，因此需要一种保证青砖茶多糖生物活性且具有高提取率的提取方法。
4.近年来，酶工程技术逐渐用于天然植物有效成分提取的一项生物工程技术，纤维素酶主要通过降解植物细胞壁，增加细胞壁的渗透性，促进中草药有效成分快速溶出和扩散，从而提高活性化合物的得率。果胶酶主要作用于细胞壁中的果胶，破坏果胶和半纤维素组成的无定形结构，协同纤维素酶进一步破坏茶叶细胞壁，有助于茶叶中有效成分的深处和扩散。利用复合酶破坏茶叶的细胞壁，茶叶细胞中茶多糖成分快速溶出，方便提取，提高多糖提取效率，且其茶多糖保留率高、安全无毒，对多糖结构和活性影响较小。因此可以作为湖北青砖茶多糖提取的主要方法。

技术实现要素：

5.针对现有技术的不足，本发明提供一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，该方法采用纤维素酶和果胶酶降解青砖茶的细胞壁，用温和的提取条件提高青砖茶多糖的提取率，并有效的保存茶多糖的生物活性。
6.本发明采用的技术方案如下：
7.一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，所述提取方法为采用复合酶法将青砖茶经酶解、抽滤、冻干得到青砖茶多糖。
8.优选的方案中，复合酶为纤维素酶和果胶酶按照质量比为1:1混合得到。
9.提取方法具体包括以下步骤：
10.(1)将青砖茶干燥、粉碎、过筛得到青砖茶粉末；
11.(2)将步骤(1)得到的青砖茶粉末加水溶解并调ph得到青砖茶溶液；
12.(3)向步骤(2)得到的青砖茶溶液中加入复合酶，经酶解、抽滤得到滤液；
13.(4)将步骤(3)得到的滤液经冷冻干燥得到粗多糖粉末；
14.(5)将步骤(4)得到的粗多糖粉末经透析袋透析得到青砖茶多糖成品。
15.优选的，步骤(1)中过筛的筛目为50-60目。
16.优选的，步骤(2)中水的体积为青砖茶粉末质量的90-100倍，ph值为3-7。
17.优选的，步骤(3)中复合酶的用量为1.0％-3.5％，酶解温度为30℃-70℃，酶解时间为1.0h-3.0h。
18.优选的，步骤(4)冷冻干燥的温度为-50～-60℃，真空度为5-10pa，时间为20-30h。
19.优选的，步骤(5)中透析袋为md34-3500透析袋。
20.有益效果
21.本发明采用纤维素酶和果胶酶制备的复合酶对湖北青砖茶中的茶多糖进行提取，并借助响应面法对茶多糖提取过程中的酶用量、酶解温度、ph值、酶解时间等关键因素进行优化，获得了适用于湖北青砖茶多糖提取的最佳方法，并且该提取方法条件温和，能有效保存茶多糖的有效成分。
附图说明
22.图1为葡萄糖标准曲线
23.图2为不同ph条件下茶多糖的提取率折线图；
24.图3为不同酶添加量下茶多糖的提取率折线图；
25.图4为不同酶解温度下茶多糖的提取率折线图；
26.图5为不同酶解时间下茶多糖的提取率折线图；
27.图6为酶添加量和酶解时间对茶多糖提取率的响应面曲线图；
28.图7为酶添加量和ph值对茶多糖提取率的响应面曲线图；
29.图8为酶添加量和酶解温度对茶多糖提取率的响应面曲线图；
30.图9为ph值和酶解时间对茶多糖提取率的响应面曲线图；
31.图10为酶解温度和酶解时间对茶多糖提取率的响应面曲线图；
32.图11为ph值和酶解温度对茶多糖提取率的响应面曲线图；
33.图12为青砖茶粗多糖对dpph自由基清除率的折线图；
34.图13为青砖茶粗多糖对abts自由基清除率的折线图。
具体实施方式
35.常用试剂及配置方法：
36.纤维素酶：购买于上海麦克林生化科技有限公司，活力单位为10000u/g；
37.果胶酶：购买于上海麦克林生化科技有限公司，活力单位为30000u/g；
38.0.2mol/l磷酸氢二钠标准溶液：准确称取磷酸氢二钠71.628g，用纯净水充分溶解后，置于1000ml容量瓶中用纯净水定容至1000ml，待用。
39.0.1mol/l柠檬酸标准溶液：准确称取柠檬酸21.014g，用纯净水充分溶解后置于1000ml容量瓶中用纯净水定容至1000ml，待用。
40.柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液：将0.2mol/l磷酸氢二钠标准溶液和0.1mol/l柠檬酸标准溶液按表1比例进行混合，分别配制成ph为3、4、5、6、7的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液。
41.表1配制不同ph的柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液
42.ph0.2mol/l磷酸氢二钠(ml)0.1mol/l柠檬酸(ml)34.1115.8947.7112.29510.309.70612.637.37716.473.53
43.0.05％蒽酮-硫酸溶液(w/v)：准确称取蒽酮50mg，溶于100ml浓硫酸(98.08％)中，需现用现配。
44.实施例1标准曲线的绘制
45.(1)精密称取干燥至恒重的无水葡萄糖标准对照品，分别配成浓度为0.025、0.050、0.100、0.150、0.200mg/ml的葡萄糖溶液，各取其1ml于具塞试管中。
46.(2)分别加入4ml浓度为0.05％的蒽酮-硫酸溶液，溶液需现用现配，马上混合，直至溶液呈碧绿，随后用连续的水流沿着试管的外壁缓慢地流动，直至手背接触试管外壁，无明显热度为止。
47.(3)沸水浴7min，后用流动的水迅速冷至室温，放置10min后，在620nm波长处测定吸光度，纵坐标为吸光度(a)，横坐标为葡萄糖浓度(c)，绘制标准曲线，计算得到标准曲线的回归方程为y＝8.2722x+0.0032(r2＝0.9996)葡萄糖标准曲线如图1所示。
48.实施例2
49.一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，具体包括以下步骤：
50.(1)将购买于湖北长盛川的青砖茶干燥、粉碎后过60目筛，获得青砖茶粉末；
51.(2)将步骤(1)得到的青砖茶粉末中加入100ml水，并用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节ph值，得到青砖茶溶液；
52.(3)向步骤(2)得到青砖茶溶液中加入1.5％的复合酶，酶解1h后抽滤得到滤液；
53.(4)将步骤(3)得到的滤液置于冷冻干燥机中冻干24h，得到粗多糖粉末。
54.(5)将步骤(4)得到的粗多糖粉末用少量水溶解后放置于md34-3500的透析袋进行透析纯化，然后将得到的纯化液置于冷冻干燥机中冻干24h，得到茶多糖成品。
55.改变步骤(2)中溶液的ph值，ph值分别为3、4、5、6和7，制备得到茶多糖成品，根据计算公式和实施例1得到的线性回归方程计算得到提取率，计算公式如下：
[0056][0057]
式中：t为多糖提取率，％；c为多糖质量浓度，mg/ml；v为体系总体积，ml；n为稀释倍数；m为样品质量，g。
[0058]
如图2所示，保持其他条件不变，茶多糖提取率在酶解ph 3-7范围内先升后降，且当ph值为6时，茶多糖提取率最高，可能是由于复合酶在一定ph范围内活性较强，当ph过高时，复合酶活性被破坏从而导致青砖茶多糖的提取率降低。
[0059]
实施例3
[0060]
方法、步骤同实施例2，保持溶液ph为5、酶解时间为1h、酶解温度为60℃、不变，仅改变复合酶的添加量，添加量分别为1.0％、1.5％、2.0％、2.5％、3.0％和3.5％，制备得到青砖茶多糖成品，并计算提取率。
[0061]
由图3可知，在保持其他条件不变的前提下，茶多糖提取率在酶添加量1％-3.5％范围内先升后降，且当酶添加量为3.0％时，茶多糖提取率最高，原因可能是当酶添加量达3.0％时，酶与底物充分接触，酶能有效分解细胞壁，使得茶多糖更易溶出，提取率达到最高。当继续增加酶的添加量，过量的酶会包裹青砖茶颗粒表面，阻碍茶多糖进一步溶出，导致茶多糖提取率下降。
[0062]
实施例4
[0063]
方法、步骤同实施例2，保持溶液ph为5、酶添加量为1.5％、酶解时间为1h不变，仅改变酶解温度，温度分别为30℃、40℃、50℃、60℃和70℃，制备得到青砖茶多糖成品，并计算提取率。
[0064]
由图4可知，当其他条件不变，仅将酶解温度从30℃上升至70℃时，茶多糖的提取率总体上呈现先升后降的趋势，其中酶解温度由50℃上升至60℃时，茶多糖的提取率增加最显著，但当酶解温度从60℃进一步提高时，茶多糖的提取率反而下降，这可能是因为酶只有在一定温度范围内才能发挥作用，温度过高或过低都会影响酶的活性。
[0065]
实施例5
[0066]
方法、步骤同实施例2，保持溶液ph为5、酶添加量为1.5％、酶解温度为60℃不变，仅改变酶解时间，酶解时间分别为1.0h、1.5h、2.0h、2.5h和3.0h，制备得到青砖茶多糖成品，并计算提取率。
[0067]
由图5可以看出，保持其他条件不变，在仅改变酶解时间的情况下，茶多糖的提取率呈现先下降再上升最后再下降的趋势。当酶解时间为2.5h时，茶多糖提取率最高，继续延长酶解时间，茶多糖提取率降低，可能是由于酶解时间过长引起多糖结构变化，导致多糖含量降低。所以最佳酶解时间为2.5h。
[0068]
实施例6
[0069]
根据实施例2-5中ph值、酶添加量、酶解温度和酶解时间四个因素及不同的水平(表2)，利用desing-expert软件对实验数据进行分析拟合，结果见表3。
[0070]
表2试验因素及水平
[0071][0072]
表3响应面实验设计及结果
[0073]
[0074][0075]
由表2数据，计算得到湖北青砖茶多糖提取率的多元回归方程：y＝4.18+0.13a+0.51b+0.69c-0.088d+0.048ab+0.21ac-0.15ad-0.12bc+0.15bd-0.068cd+0.28a2+0.32b
2-0.17c2+0.12d2。
[0076]
利用desing-expert.v8.0.6软件分析上述二次多元回归模型方差，结果见表3。
[0077]
表4回归模型方差分析
[0078]
[0079][0080]
注：差异显著(p＜0.05)；差异极显著(p＜0.01)
[0081]
回归模拟方程中，酶添加量(a)，酶解ph值(b)，酶解温度(c)与酶解时间(d)互作对茶多糖提取率影响显著。各因素对茶多糖提取率影响的主次顺序(c(酶解温度)》b(酶解ph值)》a(酶添加量)》d(酶解时间))。
[0082]
实施例7
[0083]
采用design-expert.v8.0.6软件绘制各影响因素对青砖茶多糖提取率的响应面曲线图。曲线越平直，该因素变化对结果的影响越小；曲线越陡峭，该因素变化对结果的影响越大。各因素存在交互作用，其中固定任意2个因素于零水平，其他两因素两两交互作用影响湖北青砖茶多糖提取率。
[0084]
由图6可知，酶添加量在2.7％-3.5％，酶解时间在2h-3h范围内，在其圆心处，湖北青砖茶多糖提取率容易达到最大值。由图7可知，酶添加量在2.9％-3.1％，ph值在5.5-6.5范围内时，在其圆心处茶多糖提取率容易达到最大值。由图8可知，酶添加量在在2.9％-3.1％，酶解温度在55℃-65℃之间时，在其圆心处茶多糖提取率容易达到最大值。由图9可知，ph值在5.5-6.5，酶解时间在2.2h-2.6h范围内，在其圆心处，湖北青砖茶多糖提取率容易达到最大值。由图10可知，当酶解温度在55℃-65℃，酶解时间在2.2h-2.6h范围内，在其圆心处，湖北青砖茶多糖提取率容易达到最大值。由图11可知，ph值在5.5-6.5，酶解温度在55℃-65℃之间时，在其圆心处茶多糖提取率容易达到最大值。
[0085]
由各两因素间交互作用的响应面曲线图可知，其等高线越密集，曲线越陡峭，则代表该因素对多糖提取率的效果更显著，如ad两因素交互作用对多糖提取率影响的响应面图中，a酶添加量的响应面曲线相对d酶解时间更陡峭，且等高线相对密集，表明在提取湖北青砖茶多糖过程中a的作用大于d。
[0086]
由此可以得到青砖茶多糖的最佳提取工艺为：复合酶用量3.5％，酶解ph 7，酶解温度70℃，酶解时间2.0h，此时湖北青砖茶多糖的提取率为6.34％。通过3个平行实验对湖北青砖茶多糖的提取率进行了比较，得到了6.19％的平均提取率，相对误差为2.42％，与理论计算的结果相近，表明该模型效果良好，说明了本方法的有效性和实用性。
[0087]
对比例1
[0088]
(1)取1g经粉碎机粉碎至60目筛的湖北青砖茶粉末溶于100ml水中，即料液比为1：100，得到青砖茶溶液；
[0089]
(2)在步骤(1)得到的溶液，在60℃下酶解1h；
[0090]
(3)将酶解完成后溶液进行抽滤，然后通过冷冻干燥得到青砖茶粗多糖。
[0091]
(4)将步骤(3)得到的粗多糖用少量水溶解后放置于md34-3500的透析袋进行透析纯化，得到青砖茶多糖成品，此时茶多糖的提取率为3.23％。
[0092]
对比例2
[0093]
(1)取1g粉碎机粉碎至60目筛的湖北青砖茶粉末溶于100ml水中，得到青砖茶溶液；
[0094]
(2)向步骤(1)得到的溶液在超声功率为180w(50％)的条件下60℃水浴中超声浸提，浸提时间为1h。
[0095]
(3)将步骤(2)得到的浸提液进行抽滤，然后通过冷冻干燥得到青砖茶粗多糖。
[0096]
(4)将步骤(3)得到的粗多糖经用少量水溶解后放置于md34-3500的透析袋进行透析纯化，得到青砖茶多糖成品，此时茶多糖的提取率为4.25％。
[0097]
对比例3
[0098]
(1)取1g经粉碎机粉碎至60目筛的湖北青砖茶粉末加入100ml水，并用柠檬酸-磷酸氢二钠缓冲液调节ph为7；
[0099]
(2)将步骤(1)得到的溶液中添加1.5％的复合酶(纤维素酶：果胶酶＝1:1)，在60℃下浸提2h，得到浸提液；
[0100]
(3)将步骤(2)得到的浸提液进行抽滤，然后通过冷冻干燥得到青砖茶粗多糖。
[0101]
(4)将步骤(3)得到的粗多糖经用少量水溶解后放置于md34-3500的透析袋进行透析纯化，得到青砖茶多糖成品，此时茶多糖的提取率为4.74％
[0102]
实施例8dpph自由基清除活性试验
[0103]
方法、步骤同实施例2，仅将复合酶用量改为3.5％，ph值改为7.0，酶解温度为70℃，酶解时间为2h，进行青砖茶多糖的提取，将制备得到的纯化后的茶多糖成品进行dpph自由基清除活性试验，具体步骤如下：
[0104]
(1)5％dpph醇溶液配制：称取5mg dpph，在避光条件下，加入无水乙醇，配制成5％dpph醇溶液。
[0105]
多糖样品梯度浓度溶液配制：称取50mg粗多糖，配制成2.5mg/ml多糖溶液，再分别稀释溶液至0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml。
[0106]
阳性对照vc梯度浓度溶液配制：称取200mg vc，配制成2.5mg/ml vc水溶液，再分别稀释溶液至0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml。
[0107]
(2)对tps做dpph自由基清除率测定：取各梯度多糖样品溶液2ml于10ml具塞试管中，分别加入2ml 5％dpph醇溶液，摇匀后，避光反应35min，反应结束后于517nm处测量样品的吸光度值，重复测量三次；
[0108]
(3)选用无水乙醇做空白对照，选用纯净水做阴性对照，选用vc溶液为阳性对照，于517nm处测吸光度值，重复测量三次。
[0109]
计算公式为：dpph自由基清除率/％＝[1-(a
样品-a
空白
)/a
阴性对照
]
×
100。
[0110]
式中a
样品
代表多糖溶液加入dpph溶液的吸光度值，a
空白
代表多糖溶液加入无水乙醇的吸光度值，a
阴性对照
代表纯净水加入dpph溶液的吸光度值。
[0111]
结果如图12所示，随着多糖溶液浓度的升高，dpph自由基清除率逐渐增加，当多糖溶液浓度为2mg/ml时，dpph自由基清除率最高，达94.29％，在此浓度下，阳性对照vc为96.50％，说明茶多糖具有较好的清除dpph自由基能力。说明采用该提取方法能够保留茶多糖对dpph自由基的清除能力。
[0112]
实施例9abts自由基清除活性试验
[0113]
方法、步骤同实施例2，仅将复合酶用量改为3.5％，ph值改为7.0，酶解温度为70℃，酶解时间为2h，进行青砖茶多糖的提取，将制备得到的茶多糖成品进行abts自由基清除活性试验，具体步骤如下：
[0114]
(1)准确称取0.048g abts，过硫酸钾0.01675g，蒸馏水定容至25ml，室温条件下，避光过夜12h，得abts母液。使用前用无水乙醇稀释成在734nm波长下吸光度为0.7
±
0.02的abts工作液(1:20)；
[0115]
(2)称取茶多糖配制成2.0mg/ml溶液，再依次稀释为0.5mg/ml、1.0mg/ml、1.5mg/ml、2.0mg/ml。测定过程中准备0.2ml多糖溶液，3.8ml abts溶液，避光反应10min，测定其在734nm条件下吸光度值at；
[0116]
(3)用无水乙醇代替abts工作液测定本底吸光度值ar，用纯净水代替样品溶液测得参比溶液吸光度a0；
[0117]
(4)采用vc作为阳性对照，按上述茶多糖测定方法统一测定。
[0118]
清除率由以下公式计算得到：
[0119]
abts自由基清除率(％)＝[1-(at-ar)/a0)]
×
100％。
[0120]
结果如图12所示，随着浓度升高，茶多糖的abts自由基的清除能力逐渐增加，1.5mg/ml和2.0mg/ml茶多糖对abts自由基的清除率分别为68.85％和98.31％，此时以vc作为阳性对照对abts自由基的清除率分别为99.88％和100％。表明青砖茶多糖具有一定的清除abts自由基能力，具有较好的体外抗氧化活性。说明采用该提取方法能够保留茶多糖对abts自由基的清除能力。

技术特征：

1.一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述提取方法采用复合酶法将青砖茶经酶解、抽滤、冻干得到青砖茶多糖。2.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述复合酶为纤维素酶和果胶酶按照质量比为1:1混合得到。3.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：包括以下步骤：（1）将青砖茶干燥、粉碎、过筛得到青砖茶粉末；（2）将步骤（1）得到的青砖茶粉末加水溶解并调ph得到青砖茶溶液；（3）向步骤（2）得到的青砖茶溶液中加入复合酶，经酶解、抽滤得到滤液；（4）将步骤（3）得到的滤液经冷冻干燥得到粗多糖粉末；（5）将步骤（4）得到的粗多糖粉末经透析袋处理得到青砖茶多糖成品。4.根据权利要求3所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（1）中过筛的筛目为50-60目。5.根据权利要求3所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（2）中水的体积为青砖茶粉末质量的90-100倍，ph值为3-7。6.根据权利要求3所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（3）中复合酶的用量为1.0%-3.5%，酶解温度为30℃-70℃，酶解时间为1.0 h-3.0 h。7.根据权利要求1所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（4）冷冻干燥的温度为-50~-60℃，真空度为5-10 pa，时间为20-30 h。8.根据权利要求3所述的一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，其特征在于：所述步骤（5）中透析袋为md34-3500透析袋。

技术总结

本发明涉及茶多糖类加工技术领域，具体涉及一种具有抗氧化活性的青砖茶多糖的提取方法，通过将纤维素酶和果胶酶1:1混合，制得复合酶，然后利用复合酶降解青砖茶的细胞壁，使茶多糖溶出，然后通过一系列处理制备得到茶多糖成品。该提取方法结合多糖类物质提取关键因素如酶添加量、酶解时间、pH以及酶解时间，借助响应面法优化多糖类物质的提取工艺为：复合酶用量3.5%，酶解pH为7，酶解温度70℃，酶解时间2 h，此时湖北青砖茶多糖的提取率为6.34%。优化后的提取工艺具有反应条件温和，提取率高，且不影响青砖茶多糖的抗氧化活性。不影响青砖茶多糖的抗氧化活性。