一种抗原纯化处理方法与流程

1.本发明涉及生物技术领域，尤其是涉及一种抗原纯化处理方法。

背景技术：

2.猪瘟(classical swine fever,csf)是由猪瘟病毒(classical swine fevervirus，csfv)引起的一种以高热、出血和高死亡率为特征的接触性传染病，家养和野生猪是其唯一的天然宿主。国际兽医局(oie)将其定为a类疫病，我国《动物防疫法》将其列为一类疫病，为法定上报疫病，当前无特效药，主要防治手段为疫苗接种。
3.猪瘟病毒属于黄病毒科、瘟病毒属，呈球形，核衣壳为12面体对称，有囊膜，病毒粒子表面有不规则形状的纤突。csfv为单链线状rna病毒，基因组长约12.5kb，病毒粒子略呈圆形，具有脂蛋白囊膜。中间编码区含有1个大的开放性阅读框(orf)，能编码约3898个基因，编码8种非结构蛋白和4种结构蛋白，其中4种结构蛋白分别为c、erns、e1和e2结构蛋白。而e2是csfv最主要的免疫原性结构蛋白，能够诱导机体产生中和抗体并且能够保护猪抵抗csfv强毒株的攻击，是研究猪瘟基因工程疫苗的重要靶蛋白。
4.中国仓鼠卵巢(cho)细胞是由puck于1957年在中国仓鼠卵巢细胞发现的成纤维细胞系，发展至今，已经成为外源基因的最佳真核表达系统之一，也是生物制药、疫苗开发中最常用的哺乳动物细胞。外源蛋白通过发酵培养在cho细胞中大量合成并分泌到培养基中，通过收集和纯化后得到目的蛋白，从而完成疫苗的制备。然而，细胞培养液中包含大量的细胞碎片、宿主细胞蛋白、细胞代谢物、剩余培养基、高分子聚合物等众多杂质，分离纯化后才能获得可用于免疫的目标抗原。目前，常用的抗原分离纯化手段包括离心、过滤、超滤、层析等方法。
5.但是离心、过滤等处理方法存在以下问题：1、离心后样品浊度高，耗时长、通量小，样品处理效率低；2、进行超滤浓缩工作时，杂蛋白堵塞中空纤维柱，且猪瘟e2蛋白收率低，损失大；3、抗原蛋白纯度低，疫苗副反应大。鉴于上述问题，开发一种便于放大生产、成本低、收率高、纯度高的猪瘟e2抗原纯化方法，是本领域亟待解决的技术问题。

技术实现要素：

6.本发明的目的在于提供一种抗原纯化处理方法，以解决现有技术中发酵液浊度高、收率低、纯度低、后处理困难等问题。
7.为了解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：
8.一种抗原纯化处理方法，包含以下步骤：
9.a)将收集到的细胞发酵液离心处理；
10.b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；
11.c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；
12.d)收获过滤后溶液；
13.e)对过滤后溶液进行超滤及2倍浓缩。
14.上述抗原纯化处理方法中，所述步骤a)中离心力为4000-8000g，优选为6500g；所述离心时间为15-30min，优选为20min。
15.上述抗原纯化处理方法中，所述步骤b)中硅藻土二氧化硅含量90-94％，细度为120-200目；优选为二氧化硅含量92-94％，细度为120-150目；更优选为二氧化硅含量92％，细度为150目；进一步优选的，所述硅藻土型号为celite 577。
16.所述搅拌时间为3-10min，优选为5min。
17.上述抗原纯化处理方法中，所述步骤b)中硅藻土的质量为发酵液体积的0.5-1.5％，更优选为0.5-1％，进一步优选为1％(即每升发酵液中硅藻土用量为10g)。
18.上述抗原纯化处理方法中，所述步骤c)中深层纸板的孔径为0.2-0.8μm，优选为0.2-0.6μm；更优选为0.4-0.6μm，所述深层纸板型号为ch st 130(p)。
19.上述抗原纯化处理方法中，所述步骤c)中发酵液的流速为0.25-0.8ml/(min
·
cm2)，优选为0.5ml/(min
·
cm2)。
20.本发明所提供的抗原纯化处理方法中，所述蛋白为猪瘟e2蛋白；进一步地，所述猪瘟e2蛋白由cho细胞表达得到。
21.上述抗原纯化处理方法中，所述细胞发酵液的收集步骤为：包含猪瘟e2基因的cho细胞按照流加培养工艺进行培养，培养中最高活细胞密度可达到12
±4×
106cells/ml，收获时活细胞密度在5
±2×
106cells/ml，活率在70
±
20％，收集得到发酵液。
22.发明人通过实验发现，发酵液的按照6500g进行20min离心，此时浊度为80
±
20ntu；向离心后的发酵液中加入硅藻土，硅藻土质量为发酵液体积的1％，搅拌5min；将发酵液按照0.5ml/(min
·
cm2)的流速过滤孔径为0.4-0.6μm的深层纸板，纸板型号为ch st 130(p)，收获过滤后的发酵液，此时浊度为10
±
5ntu；将过滤后的发酵液使用中空纤维柱进行超滤及2倍浓缩，蛋白收率在95％以上。
23.本技术与现有技术相比，具有以下优点：采用本技术中的抗原纯化处理方法，获得的样品溶液浊度降低75％以上，后超滤浓缩处理简单，一步获得蛋白的收率提升20％以上，总收率可达到95％以上，该方法得到的抗原制备得到的成品疫苗副反应更低；同时本技术方法操作步骤简单、人工和材料成本较低，能够应用于疫苗的大规模工业生产，提高生产效率，节约生产成本。
附图说明
24.为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案，下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图是本发明的一些实施方式，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
25.图1为实施例3中实验例的抗原浊度变化图，其中a为收获抗原，b为离心后抗原，c为澄清后抗原，d为2倍浓缩后抗原。
26.图2为实施例3中对比例的抗原浊度变化图，其中a为离心后抗原，b为2倍浓缩后抗原。
27.图3为实施例3中实验例的sds-page检测图，其中2号泳道为离心后10倍稀释sds-page蛋白定量，蛋白含量为1225.90μg/ml；4号泳道为硅藻土澄清后10倍稀释sds-page蛋白
定量，蛋白含量为1200.90μg/ml；7号泳道为硅藻土两倍浓缩后20倍稀释sds-page蛋白定量，蛋白含量为2380μg/ml。
28.图4为实施例3中对比例的sds-page检测图，其中1号泳道为离心后6倍稀释sds-page蛋白定量，蛋白含量为1000.98μg/ml；12号泳道为两倍浓缩后10倍稀释sds-page蛋白定量，蛋白含量1545.7μg/ml。
29.图5为实施例4中猪只体温变化曲线。
具体实施方式
30.下面将结合实施例对本发明的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
31.除非本文另有定义，连同本发明使用的科学和技术术语应具有本领域普通技术人员通常理解的含义。术语的含义和范围应当清晰，然而，在任何潜在不明确性的情况下，本文提供的定义优先于任何字典或外来定义。在本技术中，除非另有说明，术语“包括”及其他形式的使用是非限制性的。
32.一般地，连同本文描述的细胞和组织培养、分子生物学、免疫学、微生物学、遗传学以及蛋白和核酸化学和杂交使用的命名法和其技术是本领域众所周知和通常使用的那些。除非另有说明，本发明的方法和技术一般根据本领域众所周知，且如各种一般和更具体的参考文献中所述的常规方法来进行，所述参考文献在本说明书自始至终引用和讨论。酶促反应和纯化技术根据制造商的说明书、如本领域通常实现的或如本文所述来进行。连同本文描述的分析化学、合成有机化学以及医学和药物化学使用的命名法、以及其实验室程序和技术是本领域众所周知和通常使用的那些。
33.下面通过具体的实施例进一步说明本发明，但是，应当理解为，这些实施例仅仅是用于更详细地说明之用，而不应理解为用于以任何形式限制本发明。
34.本发明实施例中用到的主要试剂及仪器信息如下：
35.表1试剂及仪器信息表
[0036][0037]
实施例1
[0038]
步骤1：cho培养物收获
[0039]
培养过程中最高活细胞密度从12
±4×
106cells/ml逐步下降，收获时活细胞密度在5
±2×
106cells/ml，活率70
±
20％，此时收获物中含有大量的细胞及杂蛋白，浊度为1000
±
300ntu。
[0040]
步骤2：采用表2中不同的步骤组合，进行实验，其中离心力为6500g，离心20分钟，收集上清为料液；使用不同型号硅藻土及不同硅藻土加量；料液按照0.5ml/(min
·
cm2)的流速流过深层纸板(ch st 110(p))进行过滤。
[0041]
检测不同蛋白处理后得到的产物浊度和蛋白收率情况，结果如表4所示。
[0042]
其中，浊度使用浊度仪进行检测，蛋白含量使用sds-page方法进行定量检测。
[0043]
蛋白收率计算方法为：
[0044]
硅藻土澄清后蛋白收率＝硅藻土澄清后蛋白含量(μg/ml)/离心后蛋白含量(μg/ml)。
[0045]
表2不同抗原纯化处理步骤和检测结果
[0046][0047][0048]
从上述结果中可看出，采用离心+硅藻土吸附+深层纸板过滤的步骤对于样品处理上有预想不到的技术效果，特别是采用硅藻土celite 577时，样品浊度从1000
±
300ntu下降至17
±
4以下，样品接近完全澄清。其中硅藻土celite 577的质量为样品体积的2％时，样品浊度进一步下降，但发明人在后续实验中发现该组中蛋白收率也有一定程度下降，因此继续对硅藻土celite 577的用量进行进一步的筛选。
[0049]
实施例2
[0050]
采用实施例1中方法7的步骤，调整577硅藻土用量、深层纸板型号、发酵液流量参数，检测其获得的蛋白质量，计算得到蛋白收率，部分试验分组和检测结果如表3所示。
[0051]
其中，蛋白含量使用sds-page方法进行定量检测。
[0052]
蛋白收率计算方法为：
[0053]
纸板过滤后蛋白收率＝纸板过滤后蛋白含量(μg/ml)/离心后蛋白含量(μg/ml)。
[0054]
表3不同参数处理的检测结果
[0055][0056][0057]
从表3结果可以看出，当硅藻土用量为3％、2％时，使用深层纸板过滤后，浊度在15
±
4、7
±
3ntu，蛋白收率仅为52％、70％；组合3-组合9当硅藻土浓度为0.5％、1％、1.5％时，使用深层纸板过滤后，蛋白收率均在90％以上，浊度分别为17
±
3、10
±
5、7
±
2ntu。选择组合4进一步优化深层纸板型号及发酵液流量，组合6仅更换为ch st 110(p)0.5-0.8μm深层纸板，浊度由10
±
5ntu升高至17
±
4ntu；组合7仅更换为ch st 140(p)0.2-0.4μm深层纸板，浊度和蛋白收率均有所下降；组合8仅调整发酵液流量由0.5ml/(min
·
cm2)提升至1.0ml/(min
·
cm2)，浊度由10
±
5ntu升高至24
±
3ntu，蛋白收率由95％下降至89％，浊度超过20ntu，蛋白收率低于90％；组合9仅调整发酵液流量由0.5ml/(min
·
cm2)提升至0.8ml/(min
·
cm2)，浊度浊度由10
±
5ntu升高至16
±
5ntu，蛋白收率由95％下降至91％，但是浊度仍在20ntu以内，蛋白收率在90％以上；组合10仅调整发酵液流量由0.5ml/(min
·
cm2)下调至0.25ml/(min
·
cm2)，浊度由10
±
5ntu升高至13
±
4，蛋白收率由95％下降至94％，且由于流量下调，工作时间增加为组合7的2倍。因此结合蛋白处理后浊度及蛋白收率考虑，确定577硅藻土用量为0.5-1.5％，更优选为0.5-1％，进一步优选为1％；确定深层纸板孔径为0.2-0.8μm，优选为0.2-0.6μm，更优选为0.4-0.6μm，所述深层纸板型号为ch st 130(p)；确定发酵液的流速为0.25-0.8ml/(min
·
cm2)，优选为0.5ml/(min
·
cm2)。
[0058]
实施例3
[0059]
实验例：采用实施例1中方法7及实施例2中的组合4的处理方法进行抗原澄清，收集澄清后抗原并拍照，使用中空纤维柱进行2倍浓缩并拍照，如图1所示；
[0060]
对比例：将收集到的细胞发酵液进行离心，离心后上清使用中空纤维柱进行2倍浓
缩并拍照，如图2所示。
[0061]
其中，中空纤维柱2倍浓缩方法如下：
[0062]
使用慧德易超滤系统和spectrum 70kd中空纤维柱进行超滤浓缩，pbs(0.01mol/l，ph值7.4)作为缓冲液，维持tmp(跨膜压力)在0.2-0.6bar，进行2倍浓缩及超滤换液，收集最终收获液。
[0063]
蛋白收率计算方法为：
[0064]
1、硅藻土澄清后蛋白收率＝硅藻土澄清后蛋白含量(μg/ml)/离心后蛋白含量(μg/ml)
[0065]
2、2倍浓缩后蛋白收率＝2倍浓缩后蛋白含量(μg/ml)/(硅藻土澄清后蛋白含量(μg/ml)*2)
[0066]
实验例中蛋白sds-page检测图如图3所示，对比例检测图如图4所示，根据以上公式计算得出结果如表4、表5所示。
[0067]
表4对比例方法蛋白收率
[0068][0069]
表5实验例方法蛋白收率
[0070][0071][0072]
实施例4
[0073]
将对实验例和对比例收获得到的抗原进行浊度检测、定量检测，并制备疫苗后对动物进行免疫，检测不同方法得到抗原的副反应。其中浊度检测、定量检测方法同实施例1；疫苗制备方法为：将实验例和对比例中处理得到的抗原进行除菌过滤，按每头份疫苗中猪瘟病毒e2蛋白含量为40μg，将猪瘟病毒e2蛋白抗原用无菌pbs(0.01mol/l，ph值7.4)适当稀释后，与无菌植物油佐剂按照1∶1(w/w)比例混合，用高速均质机剪切乳化；动物免疫步骤为免疫步骤：取4-5周猪瘟抗体阴性猪，用猪瘟e2亚单位疫苗经颈部肌肉注射进行免疫，2ml/头，首免后21日采用同样方式加强免疫一次；副反应检测方法和评价方法为：免疫后观察猪只采食、饮水等临床表现，及时测温，评估免疫副反应，猪只体温变化曲线结果如图5所示。
[0074]
从图5中可以看出，实验例中猪只疫苗免疫后体温正常，而对比例中猪只疫苗免疫后体温呈现一过性升高，即疫苗免疫后第1-3天体温升高，第4天后体温逐步下降至正常水平。表明采用实施例1中的方法7的抗原纯化处理方法得到的抗原制备成成品疫苗，副反应更低。
[0075]
最后应说明的是：以上各实施例仅用以说明本发明的技术方案，而非对其限制；尽管参照前述各实施例对本发明进行了详细的说明，本领域的普通技术人员应当理解：其依然可以对前述各实施例所记载的技术方案进行修改，或者对其中部分或者全部技术特征进
行等同替换；而这些修改或者替换，并不使相应技术方案的本质脱离本发明各实施例技术方案的范围。

技术特征：

1.一种抗原纯化处理方法，其特征在于，包含以下步骤：a)将收集到的细胞发酵液离心处理；b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；d)收获过滤后溶液。2.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤c)中深层纸板的孔径为0.2-0.8μm，优选为0.2-0.6μm；更优选为0.4-0.6μm；进一步优选地，所述深层纸板型号为ch st 130(p)。3.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤b)中硅藻土二氧化硅含量90-94％，细度为120-200目；优选为二氧化硅含量92-94％，细度为120-150目；更优选为二氧化硅含量92％，细度为150目；进一步优选地，所述硅藻土型号为celite577。4.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤b)中硅藻土与发酵液的质量体积百分比为0.5-1.5％，更优选为0.5-1％，进一步优选为1％。5.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤c)中发酵液的流速为0.25-0.8ml/(min
·
cm2)，优选为0.5ml/(min
·
cm2)。6.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤a)中离心力为4000-8000g。7.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤a)中离心时间为15-30min。8.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述步骤b)中搅拌时间为3-10min，优选为5min。9.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述蛋白为猪瘟e2蛋白；优选地，所述猪瘟e2蛋白由cho细胞表达得到。10.根据权利要求1中所述的抗原纯化处理方法，其特征在于所述细胞发酵液的收集步骤为：包含猪瘟e2基因的cho细胞按照流加培养工艺进行培养，培养中最高活细胞密度可达到12
±4×
106cells/ml，收获时活细胞密度在5
±2×
106cells/ml，活率在70
±
20％，收集得到发酵液。

技术总结

本发明涉及一种抗原纯化处理方法，其主要包含以下步骤：a)将收集到的细胞发酵液离心处理；b)向离心后发酵液中加入的硅藻土，搅拌；c)将搅拌后发酵液以固定流速通过深层纸板过滤；d)收获过滤后溶液；e)对过滤后溶液进行超滤及2倍浓缩。采用本发明中的抗原纯化处理方法，可使得样品溶液浊度降低75％以上，成品疫苗副反应更低、操作步骤简单、人工和材料成本较低，能够应用于疫苗的大规模工业生产。够应用于疫苗的大规模工业生产。够应用于疫苗的大规模工业生产。