防辐射裙
摘要：外泌体是细胞分泌的纳米级细胞外小囊泡，携带核酸、蛋白质、脂质等生物活性物质，在机体的生理病理过程中发挥作用。与脂质体、纳米颗粒等合成载体相比，外泌体的内源性和异质性使其在疾病诊断和领域具有广泛而独特的优势。3d陶瓷打印
直径约 40-100nm 的外泌体是由细胞分泌的生物纳米级球形脂质双层囊泡，以 1.13-1.19 g ∙ mL-1 的密度漂浮在梯度溶液中。1981 年，科学家Trams 等将质膜来源的囊泡统称为外泌体，并首次提出了“外泌体”的概念，将其视为具有 5'-核苷酸酶活性的膜囊泡，可能具有生理功能，起源于各种细胞系培养物的分泌物。
外泌体 Exosomes
目前定义的外泌体（40-100nm）于 1983年 首次在绵羊网织红细胞中发现，科学家Johnstone 等人追踪了网织红细胞成熟过程中的转铁蛋白受体，发现外泌体的形成是成熟红细胞中转铁蛋白受体丢失的机制细胞。为了将它们与其他类型的细胞外囊泡 (EV) 区分开来，它们被命名为外泌体。
然而，值得注意的是，根据 ISEV 2018 指南，“外泌体”一词即使被广泛使用，也被建议替换为“小细胞外囊泡 (sEVs)”一词，由于分离方法上的困难。研究发现，外泌体含有核酸、蛋白质、脂质、细胞因子、转录因子受体等生物活性物质。其中，外泌体蛋白成分主要分为两类，一类是公共成分，参与这一过程囊泡的形成和分泌，即外泌体无处不在，包括膜转运和融合相关蛋白（如 Rab、GTPases）、热休克蛋白（如 HSP70、HSP90）、四跨膜蛋白超家族（如 CD63、CD81）、 ESCRT 复合物相关蛋白（如 Tsg101、Alix）、整合素等；另一种是特异性成分，与其祖细胞密切相关，即细胞特异性，如抗原呈递细胞来源的CD45和MHC-II。 随着外泌体研究的深入，其应用越来越广泛。外泌体可以在生理和病理过程中发挥作用，
充当细胞间通讯和物质交换的介质。同时，外泌体可以通过多种途径和位点递送多种生物活性物质和易失活或易降解的成分（指单独给药时在体内停留时间短的剂），并安全转移。
外泌体的提取制备
随着外泌体研究的深入，其潜在应用价值不断被挖掘。外泌体的可重复分离和富集将有助于评估其生物学功能。然而，外泌体在大小、含量、功能和来源方面是异质的，这使得分离变得困难。此外，目前大多数分离技术无法将外泌体与具有相似生物物理特性的脂蛋白和来自非内体途径的细胞外囊泡完全分离，导致外泌体纯度较低。因此，如何高效富集外泌体是当前的一大课题，对于外泌体的下游分析至关重要。针对不同的目的和应用，选择不同的分离方法，其中更常用的是超速离心、基于尺寸的分离技术、聚合物沉淀、免疫亲和捕获技术。 超速离心技术
超速离心 (UC) 是目前应用最广泛的分离技术，也被称为外泌体提取和分离的金标准。UC
主要根据原溶液中各组分的大小和密度差异来收获所需组分，因此适用于沉降系数差异显着的大剂量样品组分的分离。 科学家Johnstone 等人首次将该方法应用于在网织红细胞组织培养基中分离外泌体，并由 Thery 等人优化方法。超速离心主要分为两个步骤：首先，一系列连续低中速离心去除死细胞、细胞碎片和大尺寸的细胞外囊泡，然后以100,000×g的离心力以更高的速度分离外泌体，用PBS洗涤外泌体以去除污染蛋白质等杂质。研究发现离心时间、离心力、转子类型和参数都会影响目标外泌体的产量和纯度。这种方法不需要标记外泌体，可以避免交叉污染，但不利于下游由于其耗时、成本高、结构损坏、聚集成块和脂蛋白共分离而进行分析。
聚合物沉淀法
聚合物沉淀法通常以聚乙二醇（PEG）为介质，通过降低外泌体的溶解度，在离心条件下收获外泌体。这种方法最初用于分离病毒。由于外泌体和病毒具有相似的生物物理特性，因此在科学研究中经常使用这种方法来分离和纯化外泌体。比较超速离心、改性聚合物共沉淀 (ExtraPEG) 和市售的商业试剂盒三种技术，发现前两种方法优于商业试剂盒，并且 ExtraPEG 更具成本效益，在以下方面优于超速离心纯度和回收率。聚合物沉淀法操作相
对简单，分析时间短，适合处理大剂量样品。但纯度和回收率较低，容易产生假阳性，产生的聚合物难以去除，不利于后续的功能实验分析。
基于尺寸的隔离技术——超滤方法
玻璃纤维防火布
该技术主要是指超滤和尺寸排阻谱，根据外泌体与生物样品中其他成分的大小差异进行分离。
尺寸排阻谱（SEC）的分离原理是大分子不能进入凝胶孔，它们与流动相沿着多孔凝胶之间的间隙被洗脱，而小分子留在凝胶孔中并最终被洗脱通过流动相。目前，基于SEC原理的qEV分离柱、EVSecond纯化柱、Exo-spin外泌体纯化柱已上市。SEC 的应用快速、简单且成本低。分离出来的外泌体结构完整，大小均匀，其生物学特性不会受到显着不利影响，但可能掺杂其他类似大小的颗粒，导致纯度降低。
超滤方法通常使用具有不同截留分子量（MWCO）的超滤膜来选择性分离样品。这种方法的使用率约为 20%,56，在外泌体研究中经常起到辅助分离的作用。超滤法通常使用超滤管分离外泌体，成本低，富集效率高，且不影响外泌体的活性。然而，外泌体和超滤膜的纯度低和非特异性结合会降低回收率。
免疫亲和谱 (IAC)
免疫亲和层析是一种基于抗体和配体特异性结合的分离纯化技术，可将所需物质从异质混合物中分离出来。结合效率与生物亲和对、洗脱条件和基质载体密切相关。原则上，该方法应用的生物标志物（抗原）应该是外泌体膜表面的高丰度蛋白，如四跨膜蛋白超家族、ESCRT复合物相关蛋白等。当然，靶蛋白可以是外泌体表面的一种常见成分，也可以是促进IAC识别特定细胞来源外泌体的独特成分。与超速离心相比，IAC 可以用更少的样品量产生类似的结果。它还可以用于外泌体的定性和定量测定。特异性强、灵敏度高、纯度高、产量高，基于磁珠时不设定起始样品量的上限。例如，基于微孔板的酶联免疫吸附分析技术用于富集血清、血浆和尿液等体液中的外泌体。定量检测分析发现，该方法收获的外泌体产量与超速离心相当，但对样品的需求量要小得多。从400 μL血浆中提取的RNA量与2.5mL样品超速离心得到的量相同，因此比超速离心有一定优势。然而，免疫亲和层析得到的外泌体的储存条件相对苛刻，不适合用于外泌体的大规模分离。基质的非特异性干扰吸附会产生干扰蛋白，使该方法难以推广。
其他技术
目前市场上有多种基于上述传统分离技术的商业试剂盒，如exoEasy Maxi kit (QIAGEN)、MagCapture™ Exosome Isolation Kit PS (Wako)和Minute™ Hi-Efficiency Exosome Precipitation Reagent (Invent)。综合分析表明，该商品化试剂盒具有省时、产量高、完整性好等优点。但是，由于目前市售的外泌体提取试剂盒提取效果不均，目前还没有试剂盒能够从样品混合物中分离出理想的外泌体。同时，试剂盒本身价格昂贵，外泌体的产率和纯度不高。但随着外泌体分离纯化技术的不断探索、发展和创新，越来越多的新方法可供研究人员从一个或多个角度优化传统技术，具有潜在的应用价值。
外泌体的储存旋转阀门
外泌体是一种很有前途的无细胞疗法，但它们不能长期储存。因此，有必要研究外泌体的保存技术，以保护其生物学活性，方便运输和临床应用。目前，应用的保护技术主要有冷冻、冷冻干燥和喷雾干燥。
冷冻保存
黄斑对焦冷冻保存是一种将温度降低到生化反应所需温度以下以维持生物颗粒功能稳定性的储存方
法，通常在4℃、-80℃和-196℃的温度下应用。但是，这种存放方式容易出现“冻伤”。这里所说的“冻伤”，多与冷冻过程中渗透不平衡以及生物颗粒内部形成冰晶有关。为了克服这一缺陷，通常有选择地添加一种或多种适当浓度的防冻剂以延长保质期。
防冻液通常分为渗透性和非渗透性两种。其中，渗透性防冻液分子量小，能穿透细胞膜进入细胞内，防止冰晶的形成，如二甲基亚砜、乙二醇等。研究表明，从形态学角度来看，直接冷冻会影响外泌体膜的稳定性并促进其降解，而冷冻保存中添加DMSO的外泌体与新鲜外泌体相似。此外，在生物活性方面，短期冷冻保存（2 个月内）并没有显着改变外泌体的功能。非渗透性防冻剂可以与水形成氢键，通常是海藻糖、蔗糖等碳水化合物。糖通过磷脂头基和糖的OH部分之间的相互作用取代了脂质头基周围的水分子。糖的玻璃基质可以防止囊泡聚集，减少冰晶造成的伤害。考虑到安全性，双糖防冻剂是外泌体的最佳选择，其中海藻糖被列为最有效的双糖防冻剂。值得注意的是，使用前应检查防冻液的适当浓度，以保持平衡状态，防止不必要的伤害。
冷冻干燥保存咖啡玉米
冷冻干燥是将含有水分的物料预先冷却并在冰点以下冻结成固体，在真空下直接使冰升华
并以水蒸气的形式除去，从而满足储存要求的技术。冷冻干燥技术主要分为三个阶段：预冻阶段、升华干燥阶段和分析干燥阶段。冻干外泌体冻干粉可有效降低储存条件。由于它在低温、真空条件下完成产品的脱水干燥，可以保持其原有的活性，减少对生物组织和细胞体的损伤。该材料可以很容易地保持在一个恒定的可储存状态，并且可以通过简单地加水来复原。它是保存热敏材料（如 EV、疫苗和蛋白质）的合适方法。
在冷冻干燥过程中，由于产生的冷冻和脱水压力，生物分子的分子结构可能被破坏。因此，还需要选择性地添加防冻剂来保护生物材料。 科学家Charoenviriyakul 等人将 B16BL6 黑素瘤的外泌体分成三份，一份保存在-80°C，一份加入海藻糖冷冻干燥，一份直接冷冻干燥，并比较外泌体的形态、蛋白质含量和对药代动力学的影响。结果表明，海藻糖的加入可有效防止冻干过程中外泌体的聚集，增加其胶体稳定性，且不会改变外泌体的形态。冻干外泌体在室温下保存的蛋白质含量与-80°C时相似，对药代动力学的影响很小。
喷雾干燥
喷雾干燥是一种系统地应用于材料干燥的技术。EVs溶液在干燥室雾化后，水分与热空气
接触迅速蒸发，得到干粉。在此过程中，雾化压力和出口温度是影响外泌体稳定性的因素。与冻干相比，喷雾干燥是一个连续的过程，可以实现一步研磨，更经济，可膨胀，可以调整产品的粒度。
迄今为止，最好的综合贮藏方式是-80℃冷冻贮藏。然而，不同的来源和不同的实验技术都会影响外泌体长期储存稳定性的温度选择。研究发现，与新鲜提取的外泌体相比，-80 °C 下储存 4 天会改变外泌体的形态，-80 °C 下储存 28 天时外泌体的生物活性会降低。同时，一些研究表明，乳源性外泌体在-80°C 下储存 4 周，物理性质没有任何变化，紫杉醇的负载率也保持稳定。因此，研究储存稳定性迫在眉睫。从多个角度分析外泌体，尤其是长期稳定性。比如从来源、给药途径、应用技术和未来研究方向等方面。总之，有利于开展外泌体的后续功能研究，缩短实验过程，扩大其应用范围。
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议