产品使用说明书
*建议同时参考本说明书英文原文（说明书编号TB273）。
采用pET 系统进行原核蛋白表达，蛋白的表达量达到20mg/100ml 培养物并不是困难的事。在大肠杆菌中表达的目的蛋白，其可溶性（可溶蛋白或包涵体）、细胞定位（细胞质、细胞周质、培养基上清），都会对后续的纯化策略造成影响。我们建议研究者在蛋白表达后，首先进行目的蛋白的细胞定位（请参考pET 系统操作手册）；在进行大量纯化之前，小量纯化蛋白，摸索确定适合于具体蛋白的纯化条件，也是值得推荐的好方法。外源蛋白在大肠杆菌中表达，可能以可溶形式存在，也可能以包涵体形式存在。尤其在高水平表达的条件下，更容易形成包涵体。包涵体的形成与外源蛋白本身性质、载体、宿主菌、以及表达水平都有关系，可以通过选择不同表达载体和E.coli 宿主菌组合，摸索生长条件和适宜诱导条件，达到优化蛋白表达的目的。His·Tag®融合蛋白，可以在天然条件或变性条件下用NTA His·Bind 树脂或IDA His·Bind 树脂进行纯化。
内容提要
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
2. 细菌裂解获得可溶蛋白
• BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法 •
机械破碎（如超声等）
高频电子水处理器二、亲和纯化步骤
附录附录：：补充背景知识
• NTA 和IDA 化学基团域名库
• His·Bind 基质选择指南 • 在确定裂解方法前的考虑 • 蛋白可溶性及细胞定位
速记机• 天然或变性条件下目的蛋白的纯化 • 批次小量纯化或柱层析纯化方法 •
• 杂蛋白
• 如何降低非特异性结合 • 漂洗杂蛋白 • 目的蛋白的洗脱
• 纯化真核表达体系来源的His·Tag 融合蛋白 • His·Tag 融合标签的去除 •
推荐资料
Ni-NTA 树脂纯化 1. Ni-NTA 树脂的兼容性 2. 天然条件纯化 • 柱层析 • FPLC •
批次小量纯化 3. 变性条件的纯化 •
柱层析 • FPLC 纯化 •
批次小量纯化
4.
树脂再生 5. 常见问题与改善建议
一、亲和纯化样品的前处理
1. 菌液体积-起始目的蛋白量
纯化条件的优化需考虑多个因素，包括His·Tag 融合蛋白表达水平和上样量。若目的蛋白未能高效表达，需要采用一个较高的浓缩系数（concentration factor ）进行菌的裂解，即在较大培养体系中，按一定比例加入一定体积的裂解/结合缓冲液。浓缩系数定义为菌液体积与裂解/结合缓冲液体积之比。不同目的蛋白表达水平推荐使用的裂解/结合缓冲液体积、对应的浓缩系数大小，请参考表1。 例如，某蛋白表达水平约为0.1mg/ml ，需要在变性条件下进行小批提纯，则100ml 的培养物离心获得的菌体，按浓缩100倍比例重悬于含变性剂的1ml 裂解/结合缓冲液中。
在非变性条件下进行纯化时，要准确预计裂解液中可溶蛋白的含量比较困难，一般建议采用50-100倍浓缩。
表1 确定所需菌液体积
His·Tag 融合蛋白浓度
表达水平 培养体积 His·Tag 融合蛋白总量 浓缩系数
（在1ml 溶液中裂解后溶液中裂解后））
淤泥固化变性条件
50mg/L 40% 3ml 150µg 3× 10mg/L 8% 10ml 100µg 10× 2mg/ L 1.6% 25ml 50µg 25× 0.5mg/ L 0.4% 50ml 25µg 50× 0.1mg/ L 0.8% 100ml 10g 100× 天然条件
>1mg/ L >1% 50ml >50g 50× <1mg/ L
<1%
100ml <100g
100×
与其它亲和纯化介质一样，His·Bind 树脂在接近其结合载量时使用，可以获得最好蛋白分离效果。所以在蛋白纯化前估计细菌
抽提物中目的蛋白的含量，有利于确定上样量、选择合适体积的亲和树脂或预装柱。SDS-PAGE ，Western blot ，S·Tag TM
Rapid Assay ，FRETWorks TM
S·Tag Assay 等方法都可用于确定抽提物中目的蛋白的含量。
2. 细菌裂解获得可溶蛋白
•
BugBuster Master Mix 蛋白抽提方法
BugBuster Master Mix （货号71456）是将BugBuster 蛋白抽提试剂，Benzonase 核酸酶和rLysozyme™溶菌酶溶液按最优化配比混合好的一种非常方便使用的蛋白抽提试剂，有助于在最优化条件下获得可溶活性蛋白。这种预混形式的试剂减少了稀释试剂、计算各种试剂使用量和分别添加的麻烦。100ml 和500ml 包装分别足够用于20g 和100g 细胞沉淀的可溶蛋白抽提。
可溶蛋白制备
采用此操作抽提到的蛋白包括来自细胞周质和细胞质的可溶蛋白。如果欲仅收集周质部分蛋白，可以参考
Novagen 的TB055“PET 系统操作手册”中提到的渗压休克方法或其它合适的方法。渗透休克方法中得到的沉淀也可以用于以下操作以获得细胞质中的可溶蛋白。
1. 用经预先称重的离心管10,000g 离心10分钟从液体培养体系收集细胞。如果是小规模培养（如1.5ml 或更
少），可以用1.5ml 离心管14,000–16,000g 离心。尽量倾去液体，称量细胞沉淀湿重。
2. 室温下用吸打或温和涡旋使BugBuster Master Mix 与细胞沉淀混匀，每克细胞糊需要5ml 抽提试剂。这相当于
50ml 培养液采用2.5ml 抽提试剂。如果是小规模培养，则采用约1/5培养体积的抽提试剂重悬沉淀（例如，1.5ml 培养液采用300µl 抽提试剂）。如果抽提试剂过量也没有什么副作用。 选做选做：：加蛋白酶抑制剂。BugBuster Master Mix 与蛋白酶抑制剂兼容。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671），Xa 因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。 3. 室温下将重悬的细胞液在摇板或低速搅拌器上孵育10-20分钟。 注意：孵育后获得的抽提物不是粘稠的。
4. 4℃下16,000g 离心20分钟以去除不溶的细胞碎片。如果需要，沉淀可以留作“包涵体纯化”（见以下说明）
的材料。
5. 将上清转入另一个新试管。这样抽提得到的可溶蛋白溶液可以直接上样于Novagen 的纯化树脂（以及其它很
多类似纯化系统）。蛋白溶液在冰上可以短时存放（2-3小时），也可在-20℃长时间存放直至下步分析。蛋白抽提液应该根据目的蛋白的活性要求的温度存放，有些蛋白经冻融会失活。
高纯度包涵体的制备
以下操作可用于任何BugBuster®系列产品抽提的包涵体纯化。 1. 如可溶蛋白抽提步骤1-4进行操作。
2. 将步骤“4”所得到的沉淀重悬于BugBuster （货号70584），BugBuster 的量与当初重悬细胞糊的体
积相同。
吸打并涡旋以获得均匀的悬浮液。充分重悬沉淀能够溶解、去除杂蛋白以获得高纯度的包涵体。 3. 加入rLysozyme™溶液至终浓度为1KU/ml 。温和涡旋混匀，室温孵育5分钟。
注意：如果采用的是BugBuster Master Mix 就不需要另加rLysozyme 了（即可省去此步操作）。 4. 加入6倍体积的经1:10去离子水稀释的BugBuster 重悬，涡旋1分钟混匀。 5. 于4℃，5,000g 离心15分钟，以吸管移去上清，收集包涵体。
固液分离装置
6. 将包涵体重悬于相当于原培养体系体积一半的经1:10稀释的BugBuster 中，涡旋混匀，如步骤5离心。此步骤
重复两次。再次重悬，于4℃，16,000g 离心15分钟并去除上清。
7. 重悬最终的沉淀（即纯化的包涵体）于选定的缓冲液，最好是能与后续纯化方法兼容的缓冲液。包涵体可以
重悬于Novagen 的蛋白重折叠试剂盒（货号70123）中的1×溶解缓冲液（参考操作手册TB234）或其它变性剂。不溶的His•Tag®融合蛋白可以用含有变性剂的1×结合缓冲液重悬用于His•Bind®纯化（IDA 或NTA ）。
•
机械破碎机械破碎（（如超声等如超声等））
可溶蛋白的制备
稀释8×储液制成1×结合缓冲液，或按照缓冲液成分列表自己配制（参考Novagen 目录或树脂英文说明书）。 1. 10,000g 离心10分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入4ml (1:25 v/v)
缓冲液，重悬于冰浴预冷的1×结合缓冲液或1×Fractogel 结合缓冲液中。也可加入NP-40或其他非离子型去污剂至终浓度0.1％，以减少非特异性结合。若细菌菌体重悬困难，可使用匀浆器、搅拌器或超声仪帮助打散菌体。
2. 将重悬菌液置于合适大小的容器中，超声破碎。超声过程中保持菌液处于冰浴或盐冰浴中。超声条件依赖于
所使用的超声仪功率、探头种类、容器的大小形状，须实验者自己摸索。应避免连续超声导致的大量产热，可分成短时间、多次超声。通过一定的间隔时间避免溶液过热。若DNA 未能被超声剪切，裂解液会十分粘稠，可能阻塞谱柱，降低流速，影响后续的纯化过程。大量的菌体可选用弗氏压碎法(Fr
ench Press)。 可选做：
（1）细胞悬液中加入rLysozyme 溶液（货号71110）至终浓度45-60KU/g 菌体。上下吹打混匀。30℃孵育15分钟，再进行超声破碎。
（2）每1ml 裂解液加入1µI(25u) Benzonase 核酸酶（货号70746或70664）用于重悬菌体。若需在无核酸酶条件下操作，不建议使用Benzonase 。蛋白纯化过程可能无法完全除去Benzonase 核酸酶。
注意：也可选用Lysonase TM Bioprocessing Reagent(货号71230)，此试剂为rLysozyme 和Benzonase 核酸酶的混含物，可直接用于细菌裂解。每1ml 裂解液加入3µI 本试剂．即可实现高效裂解。
（3）加入蛋白酶抑制剂。蛋白酶抑制剂与BugBuster 和Benzonase 核酸酶兼容，可同时使用。如果目的蛋白后续要用凝血酶（货号69671），Xa 因子（货号69036）或重组肠激酶（货号69066）处理，就应该避免使用丝氨酸蛋白酶抑制剂。尽管纯化过程可能去除活性抑制剂，建议在酶切前最好做透析或凝胶过滤。
3. 裂解物14,000g 离心20分钟除去细胞碎片。离心后上清经0.45um 滤膜过滤，防止上样后阻塞树脂(此步操
作使用注射器式滤器更方便)。 包涵体的制备
使用1×结合缓冲液从大肠杆菌中分离、洗涤包涵体，除去杂质蛋白，再用含6M 盐酸胍或6M 尿素的1×结合缓冲液溶解包涵体。
1. 10,000g 离心10分钟收集菌体。弃上清，尽量去除培养基。按每100mI 培养基所得菌体加入40mI 1×结合
缓冲液比例重悬菌体。此步骤不加变性剂。
2. 按前述方法进行超声，重悬菌液，剪切降解核酸。
3. 5,000g 离心15分钟，包涵体和细胞碎片位于沉淀中。其他可溶蛋白部分位于上清中。
4. 移去上清，每100ml 培养物的沉淀重悬于20ml 1×结合缓冲液，重复第3步。可能需要超声以彻底重悬沉
淀。
注意： 本步操作可加入rLysozyme TM 溶液（非必要）帮助处理包涵体。已证实溶菌酶可消化细胞壁，
提高包涵体纯度。将rLysozyme 加入1×结合缓冲液至终浓度1KU/ml ，轻柔混匀，孵育5-10分钟即可离心。
5. 移去上清，按每100ml 培养物加5mI 缓冲液比例，加入含6 M 盐酸胍或6 M 尿素的1×结合缓冲液重悬沉
淀。
6. 冰浴孵育1小时，彻底溶解包涵体。16,000g 离心30分钟去除不溶成分，His·Bind 纯化之前用0.45um 滤膜
过滤上清。
二、亲和纯化步骤
Ni-NTA 树脂纯化
Ni-NTA His·Bind树脂不能耐受高浓度还原剂，如DTT、DTE，这些还原剂会还原Ni离子，使其无法与His·Tag 融合蛋白结合。被还原的树脂呈棕。多数情况下，可以使用巯基乙醇，其浓度可以加至20mM。
EDTA、EGTA，或其它强螯合剂会与Ni2+结合，将其从树脂上剥离下来。Ni2+被螯合后，树脂呈白。
对任何还原剂或螯合剂，请小心对待。若不能确定，请先在小量树脂上进行试用。应尽量避免缓冲液中含有任何高浓度供电子基团成分(如NH4+)、或裂解物中含诸如Arg、GIn、Gly、His等氨基酸。
菌体应在无强螯合剂(如EDTA)、无强还原剂(如DTT)、无离子型去污剂(如SDS)的情况下裂解。尽管确实存在某些例子，在这些试剂存在的情况下成功纯化出目的蛋白，但还是建议大家避免使用这些试剂。
更多信息请参考2。
1. Ni-NTA树脂的兼容性
2. 天然条件纯化
在决定使用天然条件（非变性条件）进行蛋白纯化之前，首先需要确定蛋白是否可溶。即使目的蛋白大部分以不溶形式表达，仍有可能有少量可溶蛋白可以用 Ni-NTA His·Bind 树脂纯化出来。
在没有强变性剂如尿素的情况下，细胞裂解物中部分不稳定的蛋白可能容易被降解。最好始终保持蛋白溶液处于低温0-4℃，并快速操作。加入AEBSF 或蛋白酶抑制剂混合物系列III 货号101500和 539134），可能帮助蛋白稳定（视具体情况而定），但是需要考虑到它们对重组蛋白的可能影响。 天然天然条件纯化所需缓冲液条件纯化所需缓冲液条件纯化所需缓冲液（（试剂盒70899）
1×Ni-NTA 结合缓冲液：（用于裂解和结合步骤） 50mM NaH 2PO 4，pH 8.0，300mM NaCl ，10mM 咪唑
（加入1/10体积的10×BugBuster 或溶菌酶能获得更好裂解效果。参见前述“制备细菌裂解物”部分。） 1×Ni-NTA 漂洗缓冲液：50mM NaH 2P04，pH 8.0，300mM NaCI ，20mM 咪唑 1×Ni-NTA 洗脱缓冲液：50mM NaH 2PO 4，pH8.0，300mM NaCI ，250mM 咪唑
柱层析
需要破碎多少菌体根据所使用的表达体系和 His·Tag ®
融合蛋白的表达水平来决定。Ni-NTA His·Bind 树脂与不同
His·Tag ®
融合蛋白的结合能力不同，通常为5-10mg/ml 。如Ni-NTA His·Bind 树脂或Ni-NTA His·Bind Superflow 对His·Tag DHFR （～26 kDa ）的结合量为0.3µmol/ml （8.0mg/ml ）。请参考表1“如何确定所需菌液体积”。 对于高表达水平的目的蛋白（每升培养基10-50mg His·Tag 融合蛋白），可用10倍浓缩的细菌裂解物。4ml 10倍浓缩的裂解物含有约0.4-2mg 的His·Tag 融合蛋白。对于低表达水平的蛋白（1-5mg/l 培养基），可以50倍浓缩，抽提200ml 菌液，获得4ml 的细菌裂解物（4mI 细菌裂解物=0.2-1mg His·Tag 融合蛋白）。
1×Ni-NTA 结合缓冲液包含10mM 咪唑，用于降低杂蛋白与树脂的非特异性结合，减少所需漂洗步骤，获得更高目的蛋白纯度。若 His·Tag 融合蛋白在此条件下无法结合到柱上，咪唑的浓度可以降低至1-5mM 。许多His·Tag
融合蛋白对Ni 2+
有更高结合力，这种情况下结合缓冲液中的咪唑浓度可以增加到20mM 。 实验材料
• 从40-200ml 菌液制备而得的澄清裂解液 • Ni-NTA His·Bind 树脂（货号70666） • 空谱柱（货号69673） • 1×Ni-NTA 结合缓冲液 • 1×Ni-NTA 漂洗缓冲液 • 1×Ni-NTA 洗脱缓冲液
Ni-NTA 缓冲液试剂盒（货号70899-3）提供各种缓冲液的浓缩储液。
1、将1ml 50% Ni-NTA His·Bind 树脂悬液加入到4ml 1×Ni-NTA 结合缓冲液中，轻柔混匀。待树脂自然沉降后，用头吸去 4ml 上清。
2、加入4ml 制备好的裂解液，轻柔摇动棍匀（旋转混合器，200rpm ）, 4℃结合60分钟。
3、将裂解液Ni-NTA His·Bind 树脂混合物加入下端封闭的空谱柱中。
4、除去柱下端封闭盖子，收集流出液（穿过峰），保存用于SDS-PAGE 电泳分析。
5、以4ml 1×Ni-NTA 漂洗缓冲液漂洗2次，收集漂洗组分，用于SDS-PAGE 电泳分析。
6、以0.5 ml 1×Ni-NTA 洗脱缓冲液洗脱目的蛋白4次。将洗脱组分分为四部分收集，并走SDS-PAGE 电泳分析各保存组分。
<231×Ni-NTA 结合缓冲液、漂洗缓冲液和洗脱缓冲液的成分可以根据具体情况进行调整以满足实验者的具体需要，如加入0.1%Tween 、5-10mM B-巯基乙醇、蛋白酶抑制剂混合物系列III 、增加NaCl 或甘油浓度等。树脂的试剂兼容性请参考表2。
FPLC
若需纯化大量蛋白，可以使用FPLC 设备，需配合Ni-NTA His ·Bind Superflow 柱使用。Ni-NTA His ·Bind Superflow 的物理稳定性使其适用于较高压力和流速的层析方式。 实验材料
·从 40-200ml 菌液制备而得的澄清裂解液
·Ni-NTA His ·Bind Superflow™（货号70691）
·1×Ni-NTA 结合缓冲液（缓冲液试剂盒货号70899） ·1×Ni-NTA 漂洗缓冲液
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