在染之前,首先用1份固定破膜浓缩液放在3份固定破膜稀释液中稀释成想要的工作液的体积,这种缓冲液储存不能超过1天。例如,检测12个样本,用3ml固定破膜浓缩液加入到9ml固定破膜稀释液中。试剂盒中所提供的破膜缓冲液是10倍浓度的,在使用前应该用蒸馏水稀释成1倍的溶液,这种破膜缓冲液应在每次使用前配成新鲜的。 1,加100µl准备好的细胞(1×106高速公路收费系统)到每一个试管里;
2,通常先标记表面分子,使用大约0.125µg FITC -CD4和0.06µg PE - CD25 抗体放在100µl 流式着缓冲液中。如果在特殊应用的时候最好滴定这些试剂。4℃避光孵化30min。Fc block可以在表面抗体孵化前加入;
3,使用冷流式细胞着缓冲液清洗,离心并弃去清洗液1500rmp离心,5分钟
4,悬浮细胞沉淀物,给每个样本加1ml准备好的新鲜固定/破膜工作液,再次悬浮溶液;
5,在暗处4℃孵化30min~18h(当用固定/破膜工作液孵化30min~18h不同的时间变化,只要用相同的供者样本,所得到的结果是具有可比性的) 6,用钢管扩口机2ml破膜缓冲液洗涤细胞,离心并弃去上层清夜;2500rmp离心,5分钟
7,重复步骤6;
8,0.5µg Fc block放在1倍破膜缓冲液,体积调整至100µl ,4℃放置15min;
9高保真拾音器,阻滞步骤后不用清洗,加0.5µg 小鼠PE-Cy5-FOXP3(FJK-16S)抗体或者PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体放入到1倍透化缓冲液中,暗处4℃至少孵化30min。要想在实验中得到最理想的染请做进一步的滴定;
10,用2ml破膜缓冲液洗涤细胞,离心并弃去上层清夜;3500rmp离心,5分钟
塑料拖把头11,重复步骤10;
12,悬浮适当的流式细胞着缓冲液体积,上流式细胞仪检测并且记录,由于固定和破膜的过程中细胞数量的FSC/SSC分布与肝细胞不同,因此需要在入口和电压上做出相应调整。
试剂盒内所含有的试剂:
FITC -CD4 0.1ml (100µl)含50µg 浓度0.5µg /µl 0.125µg=0.25µl
稀释方法:2µl FITC -CD4+18µl PBS 浓度0.05µg /µl 0.125µg=2.5µl
PE - CD25 0.25ml (250µl)含50µg 浓度0.2µg /µl 0.06µg=0.3µl
稀释方法:3µl PE - CD25+27µl PBS 浓度0.02µg /µl 0.06µg=3µl
Fc block:垃圾分类机偏瘫扶正丸 0.1ml (100µl)含50µg 浓度0.5µg /µl 0.5µg=1µl
PE-Cy5-FOXP3(FJK-16S)0.125ml (125µl)含25µg 0.5µg=2.5µl
PE-Cy5-IgG2a同型对照抗体0.125ml (125µl)含25µg 0.5µg=2.5µl