实际意 义. 常用 pH 漂移技术和光合产氧速率来研究藻类无机碳利用能力. 抑制剂包括 AZ(acetazolamide, 胞外 碳酸酐酶抑制剂), EZ(ethoxyxolamide)和 DIDS(4,4’-diisothio cyanatostilbene-2,2’-disulfonic acid, 一种阴离 子交换抑制剂, 抑制 HCO3-的转运进入细胞膜)也用于研究藻类无机碳利用途径. AZ 和 DIDS 能抑制一些 藻类或水生植物光合利用外源 HCO3−的能力, 阻止其光合过程 pH 值漂升[5−7 ]. 铜绿微囊藻和四尾栅藻是较常见的淡水藻类, 在大型浅水湖[2,8-10]和城市小水体[11-13]中出现. 对这两 株藻的光合碳利用规律有零星报道. 早年, 研究者研究过四尾栅藻[14]和铜绿微囊藻[15]的光合无机碳摄取. 近来, 文献[16]报道了 CO2/pH 对四尾栅藻的生长和光合的影响. 目前未见有利用无机碳摄取速率—总碳 浓度关系曲线或无机碳摄取速率与 pH 关系曲线上出现的第二个峰值来更好的描述藻类的碳酸氢盐利用 特性的报道. 本文利用 pH 漂移试验数据, 试用表征碳酸氢盐利用的 PCUBC 数值, 并以高 pH 值区域藻类 净光合速率为佐证, 以及 AZ 和 DIDS 对 PCUBC 和净光合速率的抑制作用强弱探讨这两株藻对碳酸氢盐 的利用能力.吸咪头
1 材料与方法
1.1 藻的培养和藻浓度确定 铜绿微囊藻 (Microcystis aeruginosa 469) 由中国科学院水生生物研究所淡水藻种库提供 . 四尾栅藻 (Scenedesmus quadricauda)从新开湖湖水中分离而得. 将藻种接种入含有 BG11 培养基的三角瓶中, 置于 25℃恒温光照培养箱中培养, 平均光照强度 100µmol/(m2·s), 光暗周期为 12:12h. 通过不断接种的方法使 藻保持在对数生长期. 试验时使用对数生长期藻. 在光学显微镜物镜
400 倍下计数藻细胞数, 测量 10-30 个藻个体的体积, 得到藻的近似体积, 假设 1 µm3 藻体的鲜湿重为 10−6µg, 换算为鲜湿藻浓度, 用 g/L(FW)表示. 1.2 净光合速率测定 藻液经过离心(铜绿微囊藻 4500r/min, 4min; 斜生栅藻 3000r/min, 3min)后, 去上清液, 用新鲜培养基 洗涤 2 次, 重新悬浮于碱度为 2.0mmol/L 的新鲜培养基中, 通氮气 3min 后装入测定瓶中, 加入不同 pH 值的缓冲液(由 MES, pH=4.5-7.5; Tris, pH=7.5-10 和 CAPS, pH=10.0-11.0 分区段调节), 缓冲浓度均为 15mmol/L). 在 25℃ 恒温 , 平均光照强度 100µmol/(m2·s) 条件下用 Clark 型氧电极 (Chlorolab2, 英国 Hansatech 公司)测定藻类光合速率, 由光合速率和藻生物量计算净光合速率(NPS, µmol/(g⋅h,FW). 抑制剂 AZ (Sigma Co., St. Louis, 美国) 和 DIDS (Fluorochem Co., UK) 对净光合速率影响的实验过 程和条件同净光合速率测定, 抑制剂在加入缓冲液前加入. 抑制率= (1-NPS1/NPS0)×100% 其中, NPS0 为对照组的净光合速率, NPS1 为添加抑制剂组的净光合速率. 1.3 光合无机碳摄取速率测定 取适量处在对数生长期的藻液, 生物量控制在 1.0g/L 鲜重左右, 将其 pH 值调节到 6.4-7.3, 然后快速 测定藻液的初始碱度, 加入适量已知浓度的 NaHCO3 溶液, 调节碱度为 2.0mmol/L. 在一系列 50mL 测定 瓶中加入上述藻液, 并用塞子封闭. 其中三瓶封入 pH 电极(pHS-3C, 上海, 雷磁). 在 25℃恒温, 平均光 照强度 100µmol/(m2·s)条件下连续记录 pH 值, 直到 pH 值至少在 1h 内不再上升为止. 最后对测定瓶中的 碳酸盐碱度、藻生物量进行测定. 在 pH 漂移试验过程中, 每隔 2h 随机选出 3 个平行样(未插电极的测定 瓶), 迅速测定每个瓶内藻液的碱度、pH 值和藻细胞密度(生物量), 计算碱度. 根据斯塔姆和摩尔根[3]的方法, 由碳酸盐碱度(Calk)和 pH 值计算 25℃时各个 pH 值对应的溶解无机 碳(DIC)浓度: [DIC] = (Calk + [H+]- [OH-])/(α1 +2α2) α0 = 1/{1+K1/[H+] +K1K2/[H+]2};
支彦丽等: 铜绿微囊藻和四尾栅藻光合利用碳酸氢盐探讨 α1 = 1/{1+ [H+]/ K1 +K2/[H+]}; α2 = 1/{1+ [H+]/ K2 +[H+]2/ K1/K2} [CO2(aq)] = α0[DIC]; [HCO3-] = α1[DIC]; [CO32-] = α2[DIC] 其中, K1 和 K2 是 H2CO3 的第一和第二解离常数, 其数值通过培养液的离子强度进行修正.
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试验过程中藻液中 DIC 浓度是随时间而下降的, 由 DIC 浓度的下降速率(运用 Origin 软件处理求得) 和藻浓度计算藻类在光合作用中, 在 25℃光合无机碳摄取速率(PCU, µmolDIC/( g•h,FW). 抑制剂 AZ 和 DIDS 对碳摄取速率影响的实验过程和条件同光合无机碳摄取速率测定. 抑制率=(1-PCU1/ PCU0)×100% 其中, PCU0 为对照组的无机碳摄取速率, PCU1 为加抑制剂组的无机碳摄取速率. 1.4 统计分析方法 对于 3 次以上的重复实验数据, 用 Origin 软件处理, 并用均值±标准差表示. 对抑制作用的显著与否, 用单因素分析(ANOVA)进行检验, P<0.05.
2 结果
2.1 净光合速率 图 1 表明, 铜绿微囊藻和四尾栅藻的净光合速率(NPS) 对 pH 值的响应大体上可以分为 3 个 pH 值区段. 在低 pH 值 区间(4.5-7.0), 铜绿微囊藻的净光合速率随着 pH 值的升高而 较大幅度升高, 在 pH 为 7.4-9.3 之间时达到最大值平台, 其 值为 408.01±3.30µmol/( g⋅h,FW)(n=6); 随后随 pH 值升高而下 降. 四尾栅藻的净光合速率在低 pH 值区间(4.4-6.5)具有较高 的 NPS, pH 在 6.0 左 右 达 到
最 大 值 815.78±23.24µmol /( g⋅h,FW)(n=5), 在中/高 pH 段虽然随 pH 值升高而略有下降, 但是仍然保持高数量值. 由于在弱碱性和碱性介质中可被藻 类利用的无机碳主要为碳酸氢盐, 而两株藻在这种介质中仍 图 1 pH 值对两株藻净光合速率的影响 Fig.1 Effects of pH values on NPS of S. quadricauda and M. aeruginosa
然有高的光合速率说明这两株藻有利用碳酸氢盐的能力; 两者中四尾栅藻的能力又比铜绿微囊藻大. 抑制剂 AZ 和 DIDS 对四尾栅藻和铜绿微囊藻净光合速率的影响如表 1 所示. AZ 对铜绿微囊藻净光合 速率有抑制作用, 在 pH 值 9.3 时, 其净光合速率的抑制率随 AZ 浓度增加而增加; 而在 pH7.4 时, 无显著性 抑制作用. DIDS 对铜绿微囊藻的净光合速率有抑制作用. 对四尾栅藻, AZ 与 DIDS 的抑制作用均较弱. 表 1 AZ 和 DIDS 对两株藻 NPS 的抑制作用* Tab.1 Inhibitition on NPS of S. quadricauda and M. aeruginosa in different treatments 铜绿微囊藻 处理 AZ1.2 AZ0.6 AZ0.8 AZ1.2 DIDS1.0 pH 7.4 9.3 9.3 9.3 9.3 抑制率(%) 10.68±1.52 12.85±0.74 16.10±0.33 26.49±3.89 20.71±0.93 ANOVA F 2.74 P 0.24 处理 AZ0.8 AZ1.2 DIDS1.0 pH 9.3 9.3 9.3 四尾栅藻 抑制率(%) 12.46±4.74 6.92±4.32 4.58± 0.58 ANOVA F 6.91 0.61 2.58 P 0.119 0.515 0.249
299.12 0.003 278.94 0.004 46.36 0.021 498.55 0.002
* n=3-6; AZ 和 DIDS 后面的数字表示其浓度, mmol/L. 2.2 光合无机碳摄取速率 由碱度(Calk)和 pH 值计算的四尾栅藻对照组代表性 DIC、HCO3−、CO32−和 CO2 浓度随时间的变化
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J. Lake Sci.(湖泊科学), 2008, 20(4)
列于图 2 中. 在光合作用的第一个阶段, DIC 浓度的下降速率与 CO2 浓度的下降速率几乎同步, 主要利用 CO2 作为无机碳源. 随着 CO2 浓度下降到很低以后 HCO3−浓度开始下降, 说明藻类开始利用 HCO3−作为 无机碳源. 由于培养液的 pH 值升高, CO32−数量开始增加. 当 HCO3−浓度降低到一定程度后, CO32−数量不 再增加, 而随 HCO3−浓度的下降而下降, 直到培养液的 pH 值稳定在补偿点为止. 测得的 PCU 与 DIC 关系曲线(图 3)与文献[14]早年报道的四尾栅藻的碳摄取速率与 CT 关系曲线的形 状和走向相符, 当碳浓度下降到一定程度后均出现碳摄取过程的第二个 PCU 峰值, 这是不能利用碳酸氢 盐的藻类无法显示的. 近年, Pierini 和 Thomaz[17]将碳摄取速率对 pH 值作图, 能更直观地反映碳摄取速 率对 pH 的响应. 我们测得的 PCU 与 pH 关系曲线也绘于图 3 中. 在图中, 漂移开始, pH 低, 对应的是高 DIC 浓度; 漂移后期, pH 高, 对应的是低 DIC 浓度(见图 2). 可见, PCU-DIC 关系曲线与 PCU-pH 关系曲 线基本符合.
pH :◆, ◇: [DIC], ▲: [ HCO3−], △: [ CO32−] , □: [CO2] 图 2 四尾栅藻藻液中 pH 和无机碳浓度随时间变化 Fig.2 Time course of pH and inorganic carbon concentrations
图 3 四尾栅藻 DIC-PCU (◆)和 pH-PCU(□) 关系曲线(n=3) Fig.3 DIC-PCU (◆) and pH-PCU (□) curve
s (n=3) of S. quadricauda from pH-drift experiments齿轮齿条转向器
铜绿微囊藻和四尾栅藻的 PCU-pH 关系曲线绘于图 4. 对铜绿微囊藻, 对照组和含 AZ0.6mmol/L 的 处理组出现两个峰值, 两峰之间存在低谷, 谷底所对应的 pH 值我们称它为 pH 转折点(简写为 pHTP). pH 值超过 pHTP 后的 PCU 值随 pH 值升高再次增加, 达到峰值后下降. 对于 pH 值超过 pHTP 的这部分 PCU 值应该是藻类利用碳酸氢盐的特征体现. 如何应用这部分数据来区别藻类利用碳酸氢盐的能力, 未见有 报道. 我们在此尝试将 pH 值超过 pHTP 的各 PCU 值取平均值, 以 PCUBC 表示, 用于表征藻类利用碳酸氢 盐的能力. 对铜绿微囊藻, pHTP 为 9.0(图 4a), 其在 25℃的 PCUBC 为 142.15µmolDIC/( g⋅h,FW)(图 5a). 同 样 , 四尾栅藻在进行光合无机碳摄取过程中也存在 pHTP 为 8.2(图 4b), 其 PCUBC 为 314.08µmolDIC/ (g⋅h,FW)(图 5b). 由于体系的 pH 值超过 pH 转折点后 , 体系中的二氧化碳浓度已经很低, 在这种条件下 藻类无机碳摄取速率仍然增加意味着该种藻类能够利用碳酸氢盐作为无机碳源. 另外, 两种藻在光合无机
图 4 铜绿微囊藻(a) 和四尾栅藻(b)的 PCU-pH 曲线(n=3) (AZ 和 DIDS 后面的数字表示其浓度, mmol/L) Fig.4 PCU-pH curves of M. aeruginosa (a) and S. quadricauda (b). Data are means ±SD (n=3) The numbers followed AZ or DIDS indicate their concentrations (mmol/L)
支彦丽等: 铜绿微囊藻和四尾栅藻光合利用碳酸氢盐探讨
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碳摄取过程中都能将混合液的 pH 值推升到 11 左右, 这也说明这两种藻能够利用碳酸氢盐作为无机碳源. 对铜绿微囊藻, 当 AZ 浓度为 0.6mmol/L 时, pHTP 向低 pH 处偏移(图 4a), PCUBC 仍然存在, 其数值为 51.53µmolDIC/( g⋅h,FW)(图 5a), 抑制率为 36.25%; 当 AZ 浓度提高到 0.8mmol/L 时, PCUBC 为 0(图 4a), 这 说明铜绿微囊藻对碳酸氢盐的摄取功能完全受到抑制, 对碳酸氢盐的利用能力完全消失. DIDS 浓度为 0.8、 1.2mmol/L 时, PCUBC 的抑制率分别为 49.10 和 52.25%(图 5a). 对四尾栅藻, AZ 浓度为 0.8mmol/L 时, 受抑制率为 20.26%; 当 AZ 的浓度提高到 1.6mmol/L 时, 其 PCUBC 为 0, 抑制率达到 100%(图 5b). DIDS 的浓度达到 1.2mmol/L 时, 其 PCUBC 仍然比较高(图 5b), 抑制率为 39.74%. 因此, 两种抑制剂对四尾栅 藻的抑制作用均小于铜绿微囊藻(图 5).
PCUBC: □, 抑制率: ♦ 图 5 铜绿微囊藻(a)和四尾栅藻(b)的 PCUBC 和抑制率 (n=3, AZ 和 D(=DIDS) 后面的数字表示其浓度, mmol/L) Fig.5 PCUBC and inhibition of M. aeruginosa (a) and S. quadricauda (b) under different treatments Data are means ±SD (n=3) The numbers followed AZ and D(=DIDS) indicate their concentrations (mmol/L)
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高温轴承shgbzc微藻或大型藻利用无机碳能力研究报道中主要的描述参数有半饱和常数(K0.5)[17−19]、pH 和无机碳
补 偿点[14,20]、生长速率[16,21]和净光合速率等. 半饱和常数值小则意味着对无机碳的利用能力强, pH 补偿点 高也意味着对无机碳的利用能力强. 铜绿微囊藻和四尾栅藻的 pH 补偿点均高达 11[14-15,20], 我们的实验结 果表明这两株藻的 pH 补偿点也高达 11. 除了上述参数以外, 我们在本文中尝试将 pH 值超过 pH 转折点 的各 PCU 值取平均值, 以 PCUBC 表示, 用于表征藻类利用碳酸氢盐的能力. 结果表明四尾栅藻对碳酸氢 盐的利用能力强于铜绿微囊藻 , 并和这两种藻在弱碱性、碱性条件下净光合速率排序相一致 . 由于将 PCUBC 用于表征藻类利用碳酸氢盐的能力只是本文的尝试, 没有文献数据可供参考, 因此有待于进一步 研究. 由 pH 漂移技术获得的 PCU-pH 关系数据 , 从利用碳酸氢盐的角度 , 可以将藻类或水生植物分为三 类 . 第一类是不能利用 HCO3−, 漂移试验中 pH 终值一般很少超过 9; 第二类是具有碳酸氢盐利用能力 者 , 其 pH 可漂移至 9 以上而 PCU 仍不为零 , 但不存在明显隆起的 PCU 峰值 , 如 Pierini 和 Thomaz[17] 对两种伊乐藻的研究结果 ; 第三类是强碳酸氢盐利用者 , 如本文研究的两株藻 . pH 值是影响水环境中 无机碳各形式丰度的一个重要因素 , 低 pH 值时 , [CO2]较高 , 这时主要是摄取 CO2 系统起作用 [22-23], 这 时的 PCU 与 CO2 浓度紧密相关 . pH 值升高 , CO2 浓度降低 , PCU 值降低 . pH 达到 9.0 后 , CO2 浓度很低 , HCO3−利用机制的作用增强 , 因此 , PCU 值回升 . 由于 pH 值继续升高后 , HCO3−浓度降低 , 故随后 PCU 值降低 , 最后为零 . 对于不能利用 HCO3−的种类 , CO2 被摄取到很低浓度后 , 光合无机碳摄取速率将降 低到零 , 体系的 pH 值不再增加 , 因此不存在高 pH 值所对应的 PCU 峰值 . 另外 , 铜绿微囊藻和四尾栅 藻的光合无机碳摄取在受 AZ 或 DIDS 完全抑制时表现出的 PCU 变化轨迹与不能利用 HCO3−的种类的 变化轨迹一样 (图 4), 这说
明抑制剂对藻类利用 HCO3−的抑制 . 四尾栅藻的光合无机碳摄取速率对体系 pH 值的响应遵循的轨迹与铜绿微囊藻相似 , 只是其 PCUBC 值比铜绿微囊藻的高 , 表明其利用碳酸氢盐
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