生长及功能的调节
吴强 余青 庞学文 吴江声 陈慰峰
【 摘要 】 目的 研究胸腺细胞对不同亚胸腺基质细胞生长及功能的调节作用。方法 胸腺基质细 胞增殖以3H 2T dR 掺入法测定, I L 27 活性以促 I L 27 依赖株法检测, 其m RN A 表达以 R T 2PCR 法检测。 结果 胸腺细胞与M T SC 4 细胞分别以 80∶1, 40∶1 或 20∶1 的比例共育时, 能明显抑制M T S C 4 细胞 的增殖, 而培养上清中 I L 27 活性无明显改变; 当两种细胞的比例为 10∶1 或 5∶1 时, 则对M T S C 4 细胞 的增殖无任何影响, 而培养上清中的 I L 27 活性明显升高。R T 2PCR 证实, 与胸腺细胞共育的M T EC 1 和 M T S C 4 细胞, I L 27 m RN A 水平明显提高。结论 胸腺细胞能促进M T EC 1 和M T S C 4 细胞分泌 I L 27, 对不同亚基质细胞的生长和功能有不同调节作用。 【 主题词 】 胸腺细胞
胸腺基质细胞
细胞增殖
白细胞介素 7
T he regula tory ef f e c t of thy m ocy t e s o n the growth an d f u n c t i on s of thy m ic stro m a l ce l ls W u Q iang , Y u Q in g , P a ng X u e w en , e t a l . D e p a r t m en t of Im m u n o logy , B e i j ing M ed ica l U n iv e r s i ty , B e i j ing 100083
【 A bstra c t 】 O bjec t i v e T o i n ve st iga te th e regu la to ry effec t o f th y m o cy t e s o n p ro life r a t i o n and fun c t i o n o f d iffe ren t typ e s o f m u r in e th y m ic st rom a l ce lls
. M e thods T h e p ro life ra t i o n o f st rom a l ce l ls w a s de te rm in ed by 3H 2T dR in co rpo ra t i o n . I L 27 ac t iv ity w a s a ssayed by th e p ro life ra t i o n o f I L 27 d e p e n 2 den t ce l l lin e an d I L 27 m RN A exp re s si o n w a s an a l yzed by R T 2PCR . Re s ults W h e n th y m o c y t e s an d M T S C 4 w e r e co c u ltu red w ith ce l l ra t i o o f 80∶1, 40∶1 o r 20∶1, th e p ro life r a t i o n o f M T S C 4 w e r e s ig 2 n if ican t ly inh ib ited , w h ile th e I L 27 ac t iv ity in sup e rn a tan t s w a s sign if ican t ly in c rea sed . R T 2PCR ana l y s is show ed th a t I L 27 m RN A exp re ssi o n in M T EC 1 w a s s ign if ican t ly i n c rea sed af te r co cu ltu red w ith th y m o - cy t e s . Con c l us i o n s T h y m o c y t e s co u ld p rom o t e I L 27 p ro d uc t i o n o f M T EC 1 an d M T S C 4, th e y h a d d if 2 fe r en t regu la t o ry effec t o n th e p ro life r a t i o n an d fun c t i o n o f d i ffe r en t typ e s o f st r om a l ce l ls
. 【 Subjec t words 】 T h y m o c y t e s
In t e r l euk in 27
T h y m ic st r om a l ce l ls C e l l g r ow th
胞提供分化、发育的信号〔2, 3〕。我们也证实了, 胸
腺 髓 质 T EC 系 (M T EC 1 ) 和 树 突 状 细 胞 系(M T SC 4) 在胸腺细胞发育、分化过程中有不同的作用〔4〕。 胸腺细胞对这两种不同基质细胞的功能及生长是否有不同的调节作用, 有待于证实。实验表明, 胸腺细胞可以促进M T EC 1 细胞
胸腺基质细胞通过与胸腺细胞相互作用, 为胸腺细胞提供分化、发育的信号。胸腺基质细
胞主要由射线耐受性上皮细胞 (T EC ) 和骨髓源 性树突状细胞和巨噬细胞组成。 在胸腺选择过 程中, T EC 诱导阳性选择, 而树突状细胞诱导 阴性选择。 尽管有报道 T EC 也能诱导阴性选 择, 但效率不高〔1〕。
近来的研究表明, 胸腺细胞和基质细胞之 间相互作用是双向性的, 胸腺细胞也为基质细
2 〔5〕 〔6〕 分泌 I L 6 , 并促进M T EC 1 细胞增殖 。
本实 验进一步研究了胸腺细胞对M T SC 4 细胞生长 及细胞因子分泌的影响, 并比较了胸腺细胞对M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞分泌 I L 27 的不同调节作用, 为深入理解胸腺细胞对胸腺微环境的调节作用, 提供实验依据。
课题受国家自然科学基金资助( 39230320)
作者单位: 100083 北京医科大学免疫系〔吴强, 余青, 庞学 文, 陈慰峰( 联系人) 〕, 组织胚胎系( 吴强, 吴江声)
以 570nm 及 630n m 波长测吸光度, 结果以A 值表示。
材料与方法
61 总 RNA 提取: 取 5×106 细胞, 按 C h om czyn sk i
和 Sacch i 法提取总 RN A , RN A 以紫外分光光度计定 量并以电泳鉴定完整性。
71RT - P CR : 5 ×106
细胞来源的总 RN A 经变性,
在
含 2 0U RN A 酶 抑 制 剂 , 1 0 0 p m o l I L 27 上
游 引 物 , 0. 2mm o l ƒL d N T P , 1×逆转录缓冲液和
15U AM V 逆 转录酶的 20Λl 反应体系中, 42℃反应 30 分钟。取逆转 录产物 10Λl 进行 PCR , 50Λl 反应体系含 1×PCR 缓冲 11 实验动物: BA L B ƒc 小鼠, 4
～ 6 周龄, 雌性, 本校 动物部提供。
21 主 要 试 剂: ( 1) DM EM 细胞培养基, S ig m a 产 品。(2) 3H 2T dR , 比活性 1184M B q (32m C i ) ƒm m o l , 购自 上海原子能研究所。(3) 丝裂霉素C (M M C ) , Kyow a 产 品。 (4) 内切酶 B am H I 购自华美生物工程公司。 ( 5) AM V 逆转录酶和 T aq DN A 聚合酶均购自 P rom ega 公司。 ( 6 ) 引 物 及 探 针: m r I L 27 上
游 引 物 T T A T G 2 G A GT GCCA C A T TA A A G A C 和 下 游 引 物
C GGGA T T CC T T A TA TA C T GCCC T T , 由
上 海 生 物 工程公司合成; m I L 27 c DN A 探针切自 p CD 2m I L 27 质 粒, 后者由美国 DN A X 研究所惠赠。 ( 7) DN A 标记及检测试剂盒, 购自 P rom ega 公司。
31 细 胞 系: ( 1 ) BA L B ƒc 小 鼠 胸 腺 上 皮 细 胞 系
(M T EC 1 ) 以 及 树 突 状 细 胞 系 (M T SC 4 ) , 均 来 源 于 BA L B ƒc 小鼠胸腺, 本室所建, 体外传代培养, 可自发
分泌 I L 27〔7〕
。(2) C lo n e K 细胞株, 为 I L 27 依赖性细胞, 用于测定 I L 27 活性。
41 细胞增殖试验: ( 1) 用DM EM ( 含 10%N C S ) 将
M T S C 4 细胞浓度调至 6×104
ƒm l , 加入 96 孔板, 每孔 100Λl, 过夜贴壁。取BA L B ƒc 小鼠胸腺细胞, 调浓度为
106 ƒm l , 加入M M C ( 终浓度 50Λg ƒm l ) , 5% C O 2 , 37℃ 培养箱内, 孵育 20 分钟后, 用 H an k s 液
( 含 2% N C S ) 洗三遍, 然后用DM EM 调成不同浓度, 加入已经贴壁
生长M T SC 4 细胞的 96 孔板内, 每孔加 100Λl 胸腺细
液, 1. 5m m o l ƒL M gC l 2 , 0. 2m m o l ƒL d N T P , 100pm o l
I L 27 上游和下游引物及
2. 5U T aq DN A 聚合酶, P CR 反应为 97℃ 20 秒, 54℃ 30 秒, 72℃ 1. 5 分钟, 进行 30
个循环, 同时作 I L 27 c DN A 的 PCR 对照。
81RT - P CR 产物的 Sou t hern 杂交: 取 10Λl PCR 产
物, 在 2% 琼脂糖凝胶中电泳, 转印至尼龙膜, 与 标记的 I L 27 c DN A 探针杂交, 探针标记及杂交显过 程按DN A 标记及检测试剂盒说明书进行。
结 果
11 胸腺细胞对 M TSC 4 细胞增殖的影响:
胸腺细胞对M T SC 4 细胞增殖的影响呈明显的
剂量依赖关系。 当胸腺细胞与M T SC 4 细胞以
80∶1, 40∶1, 20∶1 共育 72 小时后, 能明显抑
制M T SC 4 细胞的增殖; 当比例为 10∶1 和 5∶
1 时, 则对M T SC 4 细胞的增殖不产生任何影
响 (图 1)。 用 Eo s i n Y 拒染法计活细胞数目发
现, 胸腺细胞并不促进M T SC 4 细胞的死亡。M T SC 4 细胞和胸腺细胞共育 48 小时后, 死细
胞低于 2% (附表)。
21 胸腺细胞抑制M TSC 4 细胞增殖的动力 学: 胸腺细胞与M T SC 4 细胞以 40∶1 共育 12 小时, 即可明显抑制M T SC 4 细胞的增殖, 而且 在不同时间点, 与胸腺细胞共育的M T SC 4 细 胞增殖的速度均低于单独培养的M T SC 4 细胞 (图 2)。
31 胸腺细胞对M TSC 4 细胞及M TE C 1 细
胞产生 I L - 7 的影响: 胸腺细胞对M T SC 4 细胞
产生 I L 27 的影响呈剂量依赖关系。
当胸腺细胞 胞 悬 液,
继 续培养7 2 小时, 结束培养前8 小时, 加入1 8. 5 k B q
( 0. 5ΛC i ) ƒ孔3
H 2T dR , 培养结束后, 用液闪仪测 cpm
值。 (2) 用DM EM (含 10% N C S ) 将M T S C 4 细胞浓度
调为 6×104
ƒm l , 加入
96 孔板, 每孔 100Λl , 过夜贴壁。 胸腺细胞处理方法同 (1) , 调浓度为 2×106 ƒm l , 加入已
经贴壁生长M T S C 4 细胞的 96 孔板内, 每孔加 100Λl 胸 腺 细 胞悬液, 继续培养12～ 72小时, 结束培养前6小时, 加入
5kB q ƒ孔3
H 2T dR , 培 养 结 束 后, 用 液 闪 仪 测 cpm 18. 值。
51 I L - 7 产生及测定: ( 1) I L 27 产生: 用 DM EM ( 含 10% N C S ) 分别将M T S C 4 细胞和M T EC 1 细胞调成 5
×104
ƒm l , 并加入
24 孔板, 每孔 1m l , 过夜贴壁后, 弃上 清, 再加入含不同数量的经 M M C 处理的胸腺细胞 1m l , 5% C O 2 , 37℃培养箱内, 继续培养 72 小时, 收集 上清过滤, 220℃冻存, 待测。(2) I L 27 测定: 96 孔板每孔 加入 C lo n e K 细胞悬液 100Λl ( 5
×104 细胞ƒ孔) , 再加 待测上清 100Λl , 培养 48 小时后, 离心弃上清, 加入 1m g ƒm l 的M T T 溶液 50Λl ƒ孔, 继续培养 4 小时, 离心
与 细胞以 40 ∶1 共育时 , 其培养上清 M T SC 4 的 I L 27 活性与单独M T SC 4 细胞培养上清无
∶1 共育时, 其培养上清的 I L 27 活性则明显高 于M T SC 4 细胞单独培养上清 (图 3)。不同数量 的胸腺细胞与M T EC 1 细胞共育 72 小时, 其培
养上清的 I L 27 活性均高于M T EC 1 细胞单独
培养上清 (图 4)。
41 胸腺细胞对M TSC4 细胞及M TE C1 细胞
附表 胸腺细胞对M TSC 4 增殖的抑制作用
T a ble . I n h i b i t i o n M TSC 4 pro l i f e ra t i o n by thy m ocy t e s
图 3 胸腺细胞对M TSC 4 产生 I L - 7 的影响
图 1 不同胸腺细胞数量对M T SC 4 增殖的影响
F ig 1. I n f l uen c e of d i f f e ren t n u m ber s of thy m o -
cy t e s o n M TSC 4 pro l i f e ra t i o n
3 3 3 P < 0. 01, c om p a red w ith M T SC
4 cu ltu red a lo ne
F ig 3. E f f e c t of thy m ocy t e s on I L - 7 produc t i o n of M TSC 4
3 3 3 P < 0. 01, c om p a red w ith M T SC
直埋电缆盖板
4 cu ltu red a lo ne 3 P < 0. 05, c om p a red w ith M T SC 4 cu ltu red a l o ne
图 4 胸腺细胞对M TE C 1 产生 I L - 7 的影响
图 2 胸腺细胞抑制M T SC 4 增殖的动力学
F ig 4. E f f e c t of thy m ocy t e s on I L - 7 produc t i o n of M TE C 1
3 3 3 P < 0. 01, c om p a red w ith M T EC 1 cu ltu red a lo ne
F ig 2. K i n e t i c s of the i n h i b i t i o n of thy m ocy t e s o n M TSC 4 pro l i f e ra t i on
3 3 3 P < 0. 01, 4
能扩增出 I L 27 cDN A 编码区中 400bp 长的片 段。R T 2PCR 和 So u th e r n 杂 交 结 果 显 示, 从
M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞及与胸腺细胞共 育后的M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞 RN A 中, 均能扩增出 400bp 长, 与 I L 27 cDN A 探针特异 数量不到同时形成的胸腺细胞数量的 1ƒ1000,
提示胸腺细胞在发育过程中, 始终都和胸腺树
突状细胞相互作用。本试验进一步证实, 胸腺细 胞能够抑制树突状细胞系 M T SC 4 细胞的增
程控步进衰减器系统
殖。
尽管当胸腺细胞与M T SC 4 细胞以 10∶1 以 下的比例共育时, 对M T SC 4 细胞的增殖不产 生任何影响, 但是这种比例关系, 远远低于胸腺
内实际的胸腺细胞和树突状细胞之间的比例。因此, 本试验结果有可能反映了胸腺细胞和树突状细胞在发育过程中的相互调节关系。 与
M T SC 4 细胞相反, 胸腺细胞可以促进M T EC 1
细胞的增殖〔6〕。体内实验也证实〔2〕, 胸腺上皮细
胞的发育和存活依赖于胸腺细胞, 一般认为, 胸 腺细胞和胸腺基质细胞通过细胞2细胞相互作
用以及分泌的细胞因子相互调节。 胸腺细胞通 过何种机制对不同亚基质细胞的增殖产生截 然不同的影响, 还需进一步探讨。
胚胎造血干细胞迁移到胸腺原基的第二 天, 胸腺基质细胞即开始表达 I L 27 m RN A , 提 示 I L 27 对胚胎早期胸腺细胞发育的作用〔8〕。我 室建立的M T SC 4 细胞和M T EC 1 细胞均能分
泌 I
L 27〔9〕
。经M M C 处理的胸腺细胞与M T EC 1 细胞共育后, M T EC 1 细胞培养上清的 I L 27 活 性明显增强。 而胸腺细胞对M T SC 4 细胞分泌
I L 27 的影响则呈剂量依赖关系, 当胸腺细胞与
M T SC 4 细
胞 以 40 ∶ 1 共 育, 虽 可 明 显 抑 制 M T SC 4 细胞的增殖, 但是培养上清中的 I L 27
活性与M T SC 4 细胞单独培养上清比, 无显著
改变; 当以 10 ∶1 共育后, 培养上清的 I L 27 活
性明显高于M T SC 4 细胞单独培养上清。 因此
在本试验条件下, 胸腺细胞无论以何种比例与
M T SC
4 细胞共育都能促进M T SC 4 细胞分泌
I L 27。R T 2PCR 证
本振频率实, 经 胸 腺 细 胞 作 用 后 的 杂交的片段, 因而均有 I L 27 m RN A 的表达; 在 细胞数目相同的条件下, 与胸腺细胞共育后的 M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞, 其特异性杂交信 号的强度明显高于未共育的同类型细胞, 表明 与胸腺细胞共育后, M T EC 1 细胞和M T SC 4 细 胞中 I L 27 m RN A 的水平明显提高 (图 5)。
图 5 胸腺细胞对基质细胞表达 I L - 7 m RNA 的影
响
F ig 5. E f f e c t of t hy m ocy t e s o n I L - 7 m RNA ex -
pre s s i o n of M TSC 4 讨 论
M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞分别为小鼠 胸腺上皮细胞系和树突状细胞系, 体外实验发 现, M T EC 1 细胞能抑制胸腺细胞发生凋亡, 而
M T SC 4 细胞则促进胸腺细胞发生凋亡〔4〕
。提示 这两种不同亚的基质细胞在 T 细胞抗原识别 受体库形成中, 发挥不同的作用。尽管胸腺树突 状细胞是一个数量很少的细胞亚, 但在胸腺 选择过程中却有重要作用, 通过诱导胸腺细胞 的阴性选择, 确保自身反应性 T 细胞被克隆清 除。有实验证实〔7〕, 胸腺细胞和树突状细胞来源 于同一前体细胞, 新的胸腺细胞形成, 总是伴有 树突状细胞的形成, 但是新形成的树突状细胞水溶液锂电池
M T EC 1 细胞和M T SC 4 细胞, I L 27 m RN A 的
表达均增加, 提示胸腺细胞可通过不同的机制 调节基质细胞的生长及功能。 小鼠胚胎胸腺
器官培养中加入 I L 27, 可使
胸腺细胞数目增加, 并且胸腺细胞数目的增加 与 I L 27 的剂量成正比〔10〕。 抗 I L 27 抗体能阻断
胞各亚的影响表明, I L 27 选择性促进 CD 4-
发动机散热器
序性死亡的不同作用, 中华微生物学和免疫学杂志, 1996,
16∶2842288.
吴强, 庞学文, 钱晓萍, 等 1 胸腺细胞对小鼠胸腺上皮细胞 系分泌 I L 26 的促进作用 1 中华微生物学和免疫学杂志, 1996, 16∶4182421. 吴强, 吴江声, 陈慰峰 1 胸腺细胞对小鼠上皮细胞系增殖的
影响
1 中华微生物学和免疫学杂志, 1997, 17∶2762279. A rdav in C , W u L , L i CL , e t a l
. T h ym ic dend r it ic ce lls a nd T ce lls deve lop si m u ltaneo u sly in th e th ym u s f r om a comm o n
p recu r so r pop u la t io n . N a tu re , 1993, 362∶7612763.
芯片破解
W ile s M V , R u iz P , I m ho f BA . I n te r leuk in 27 exp re ssio n du r 2
ing m o u se th ym u s deve lopm en t . E u r J I
mm uno l , 1992, 22∶ 103721042.
余青, 庞学文, 陈慰峰, 等 1 九株胸腺基质细胞系自发分泌 白细胞介素 7 的能力 1 中华微生物学和免疫学杂志, 1993, 13∶2912294.
8-
和 C D 4+ 8- 或 CD 4- 8+ 细 胞 的 增 殖, 其 中
5
CD 4- 8- 细胞数目增加最多〔11〕
, 这一结论与 I L 2
7 受体只在 C D 4- 8- 和 C D 4+ 8- 或 C D 4- 8+
细胞 表达, 而 C D 4+ 8+ 细胞表面 I L 27 受体阴性相一
致〔12〕。在胸腺细胞发育过程中, 虽然树突状细胞
介导阴性选择, 但这一过程发生在 C D 4+ 8+
细 胞, 与树突状细胞分泌 I L 27 促进胸腺细胞的发 育并不矛盾。从而提示, 胸腺树突状细胞对胸腺 细胞的发育亦有正反两方面的作用, 一方面介 导 CD 4+ 8+ 细胞阴性选择, 清除自身反应性 T 细胞; 另一方面可能通过分泌细胞因子促进
CD 4- 8-
细胞的分化、
发育。 6 7 8 9
10 W a sto n JD , M o r r issey PJ , N a m en A E . e t a l . E ff ec t o f I L 27
o n th e g r ow th o f f r t a l th ym o cy te s in cu ltu re . J I mm uno l , 1989, 143∶121521222.
11 P l um J , Sm ed t M D , L ec le rcq G, e t a l . E xo geno u s I L 27 p r o 2
m o te s th e g r ow th o f CD 3- CD 4- CD 8- CD 44+ CD 25- ƒ
i n
p recu r so r ce lls and b lo ck th e d iff e ren t ia t io n p a thw ay o T CR 2ΑΒ ce lls in f a t a l th ym u s o rgan cu ltu re . J I mm uno l , 1993, 150∶270622716.
12 Sudo T , N ish ik a w a S , O h no N , e t a l . E xp re ssio n and f unc 2
t i o n o f th e in te r leuk in 7 recep to r in m u r ine ly m p ho cy te s .
P r o c N a t l A cad A c i U SA , 1993, 90∶912529129.
参 考 文 献
1 V uc m ano v ic S , G randea A G , F aa s SJ , e t a l . Po sit ive se
l ec 2 t io n o f T 2lym p ho cy te s induced by in t ra th ym ic in jec t i o n o f a
th ym ic ep i th e lia l ce l l line
. N a tu re , 1992, 359∶7292732. Sho re s E
W , V an Ew ijik W , S inge r A . D iso rgan iza t io n and re sto ra t io n o f th ym ic m edu lla ry ep ith e lia l ce ll recep to r 2ne g 2 a t ive sc id m ice ∶ ev i dence th a t recep to r 2bea r ing lym p ho 2 cy te s inf luence m a t u ra t i o n o f th e th ym ic m ic r o env i r o n 2
m en t . E u r J I mm uno l, 1991, 21∶165721661. R it te r M A , Bo yd RL. D eve lopm en t in th e th ym u s : it tak e s tw o to tango . I mm uno l T o d ay , 1993, 14∶4622469. 董海东, 庞学文, 陈慰峰 1 两种胸腺基质细胞对胸腺细胞程
2 3
( 收稿: 1997206211
修回: 1997210220)
4
双歧杆菌对裸鼠腹腔巨噬细胞产生 I L - 1、I L - 6、I L - 12 的影响
王立生 潘令嘉 施理 孙勇 张亚历 周殿元
双歧杆菌是人体及动物肠道内最重要的生理性细
菌, 在体内发挥着生物学屏障、抗感染、抗突变、抗衰 老、免疫赋活及抗肿瘤等多种生理功能, 本文以青春双 歧杆菌注射于裸鼠腹腔, 用小鼠胸腺细胞增殖法、 EL ISA 法分别检测它刺激裸鼠腹腔巨噬细胞后产生的 I L 21 活性, I L 26 及 I L 212 含量。结果表明双歧杆菌注射 组裸鼠腹腔巨噬细胞产生的 I L 21 活性为
0. 55±0. 024 化内科研究所 值) , I L 26 及 I L 212 含量分别为 819. 80±201. 40p g ƒ(A m l 及1 1 9 4. 7 5±1 8 5. 7 2p g ƒm l ; 而对照组则为0. 3 4 ± 0. 021、303. 78±171. 75 和 839. 13±132. 97。三者在双 歧杆菌注射组均显著高于对照组 (P < 0. 01)。提示青春 双歧杆菌可激活裸鼠腹腔巨噬细胞, 使之产生较多量
的 I L 21、I L 26 及 I L 212。由于 I L 21、I L 26 及 I L 212 在体内 外均具有显著的抗肿瘤作用, 因此这三种细胞因子的
诱生可能部分介导了双歧杆菌的抑瘤作用。
作者单位: 510515 广州, 第一军医大学南方医院全军消
( 收稿: 1998201223
修回: 1998204228)
豫公网安备41160202000603
站长QQ:729038198
关于我们
投诉建议