17味中药对豚鼠皮肤TNF-α、IL-10作用的影响 姜丽莎;张晓东;张国斌;张庆瑞;王强
【摘 要】目的 探讨17味中药对豚鼠皮肤肿瘤坏死因子-α(TNF-α)、白细胞介素-10(IL-10)的调节作用.方法 实验动物随机分4组,17味中药乙醇提取液为实验组,8-甲氧补骨脂素(8-MOP)、75％乙醇为阳性及阴性对照组,均涂于豚鼠皮肤上,40 d后取皮肤标本免疫组化染,测TNF-α、IL-10平均光密度,比较其作用结果.结果 当归、甘草、枸杞、红花、女贞子、首乌、益母草、黑芝麻、栀子对TNF-α表达下调;甘草、枸杞、合欢皮、黄芪、女贞子、沙参、沙苑子、菟丝子、黑芝麻对IL-10表达上升,其中甘草、枸杞、女贞子、黑芝麻对TNF-α、IL-10均表现正向调节作用;合欢皮、黑桑葚对TNF-α表达上调,旱莲草、黑桑葚使IL-10表达下降,出现负向调节作用.结论 通过中药对TNF-α、IL-10调节作用探讨,为研制白癜风的有效组方提供可靠实验数据. 【期刊名称】《中国中西医结合皮肤性病学杂志》
【年(卷),期】2016(015)003
【总页数】3页(P169-171)
【关键词】中药;豚鼠;肿瘤坏死因子-α;白细胞介素-10;白癜风
【作 者】姜丽莎;张晓东;张国斌;张庆瑞;王强
【作者单位】辽宁医学院研究生学院,锦州121001;解放军第202医院,沈阳110003;解放军第202医院,沈阳110003;解放军第202医院,沈阳110003;解放军第202医院,沈阳110003
【正文语种】中 文
【中图分类】R285.5
目前认为白癜风（Vitiligo）是多基因遗传的自身免疫性疾病，多种免疫细胞及细胞因子参与了疾病的发生。肿瘤坏死因子-α（TNF-α）在皮肤中主要由角质形成细胞分泌，具有显著抑制黑素细胞增殖和降低酪氨酸酶活性的作用［1-2］。白细胞介素（IL）-10是近年来发现的一种重要的负调节因子，其可能通过影响细胞因子合成，参与白癜风发病［3］。 中医药白癜风有悠久的历史，我们依据疏肝解郁、活血祛风辨证理论为法则组方，红
蚝排花复方制剂白癜风，取得良好效果［4］，本研究观察该制剂中的17味中药乙醇提取液对豚鼠皮肤TNF-α与IL-10的作用，以探讨其作用机制并为最佳组方提供可靠的实验数据。
1.1 材料微调电容
1.1.1 实验动物 棕黄豚鼠24只（辽宁长生生物技术有限公司），体质量350 g左右，雌雄各半兼用。 1.1.2 试剂 0.1%8-甲氧补骨脂素（8－MOP）-甲氧（重庆华邦制药有限公司，批号H50021839），即用型免疫组化SP试剂盒（福州迈新生物技术开发有限公司），兔抗鼠IL-10多克隆抗体和兔抗鼠TNF-α多克隆抗体（武汉博士德生物工程有限公司），DAB显试剂盒（北京中衫金桥生物技术有限公司）。
1.1.3 主要仪器 中药粉碎机（ST-10B，永康市帅通工具有限公司），电子称（BS124S，德国赛多利斯集团），超声机（KQ-400DB，昆山市超声仪器有限公司），自动组织脱水机、烤片机、生物组织包埋冷冻机（天津天利航空机电有限公司），共览显微镜（DMD108），电热恒温培养箱（上海新苗医疗器械制造有限公司）。
1.2 方法
1.2.1 药物制备 黄芪、当归、白芷、女贞子、枸杞、菟丝子、沙苑子、旱莲草、首乌、沙参、黑芝麻、黑桑葚、益母草、甘草、合欢皮、红花、栀子17味中药，80℃烘干粉碎，20目筛出取粗粉10 g，分别用75%乙醇100 mL，室温密闭浸泡24 h，超声提取2 h，滤过，即得浓度为0.1 g/mL的中药提取液，于4℃冰箱中保存备用。
三足式离心机
1.2.2 实验分组 实验分中药实验组，8-MOP阳性对照组，75%乙醇阴性对照组。取豚鼠24只，随机分4组，每组6只。每只实验动物背部取6个3 cm×3 cm相隔离区域剪毛，暴露皮肤，以便涂擦药物。外用中药提取液分别涂擦每个隔离脱毛区，并每只均涂0.1%8-甲氧补骨脂素酊与75%乙醇做阳性、阴性对照。涂豚鼠脱毛区，每次用0.5 mL，2次/d，连续40 d。在涂药时要反复擦，尽量使之渗透。各组涂药后1h，日光灯照射15 min（功率40 W，距离30 cm）。每组豚鼠每3天脱毛1次。
1.2.3 取材 末次给药后1 h，实验动物20%乌拉坦麻醉（0.5 mL/100 g），用药部位中心取1 cm×1 cm皮肤。皮肤标本给予10%甲醛固定石蜡包埋。
1.2.4 结果测定及判定 测定TNF-α与IL-10水平按试剂盒说明操作。TNF-α和IL-10标记阳性的切片为表皮细胞浆或细胞膜出现棕黄颗粒，见图1、2，每张切片随机选取5个高倍（×40倍物镜）视野观察，并采图测量光密度值。应用Image-Pro Plus 6.0软件处理系统测定视野中表皮层中阳性细胞平均光密度。
1.3 统计学方法 实验数据用±s表示，应用SPSS17.0软件处理系统进行数据的统计，计量资料采用单因素方差分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。
2.1 TNF-α与IL-10阳性细胞主要分布于表皮基底层、棘层、颗粒层，少数阳性细胞分布在真皮浅层。
2.2 17味中药对TNF-α的影响 对TNF-α下调：当归、甘草、枸杞、红花、女贞子、首乌、黑芝麻、栀子与75%乙醇对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；益母草与75%乙醇对照组比较，差异有统计学意义（P＜0.05）；对TNF-α上调：合欢皮、黑桑葚与75%乙醇对照组比较差异有统计学意义（P＜0.05）；对TNF-α无影响：白芷、旱莲草、黄芪、沙参、沙苑子、菟丝子与75%乙醇对照组比较差异无统计学意义。见表1。
2.3 17味中药对IL-10影响 IL-10上升：甘草、枸杞、合欢皮、黄芪、女贞子、沙参、沙苑子、菟丝子、黑芝麻与75%乙醇对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；IL-10下降：旱莲草、黑桑葚与75%乙醇对照组比较差异有统计学意义（P＜0.01）；对IL-10无影响：白芷、当归、红花、首乌、益母草、栀子与75%乙醇对照组比较，差异无统计学意义。见表1。
白癜风的发生和发展与自身免疫系统各个方面、各个环节存在密切的联系，而机体的免疫应答大部分经由细胞因子调控，所以细胞因子与白癜风的发病关系就显得尤为重要。目前以机体内各种细胞因子之间的相互调节和影响为特点的免疫学说受到广泛重视［5-6］。
TNF-α在皮肤中能够显著地降低黑素细胞活力，减少黑素细胞增殖及黑素细胞酪氨酸酶和酪氨酸酶相关蛋白-1的含量［7］。研究表明白癜风患者皮损内TNF-α表达高于正常人皮肤，并表现出对黑素细胞增殖的抑制作用，且与浓度呈正相关，即浓度越高，抑制作用越明显［8］，同时可对黑素细胞造成免疫攻击，从而导致素脱失［9-10］。本实验结果表明，当归、甘草、枸杞、红花、女贞子、首乌、益母草、黑芝麻、栀子对豚鼠TNF-α起下调作用，可有效地降低TNF-α浓度，减少对黑素细胞增殖的抑制作用，在一定程度上增加了酪氨酸酶活性，提高黑素细胞活力，促使黑素细胞增殖。
IL-10是近年来发现的一种与Th2免疫应答密切相关的负调节细胞因子，主要来源于Th2细胞、B细胞及单核巨噬细胞的分泌，几乎能够抑制所有细胞因子的合成与释放，是目前发现的重要免疫抑制性因子之一［11-12］。Tahers等［13］研究发现白癜风患者血浆中IL－10水平显著低于正常对照组，说明白癜风的发病可能与IL－10的下降相关。甘草、枸杞、合欢皮、黄芪、女贞子、沙参、沙苑子、菟丝子、黑芝麻在实验中对IL-10起到上升调节作用，表现出较强的免疫和炎症抑制作用，并抑制巨噬细胞的活化，通过影响细胞因子合成而影响白癜风的发展。实验中，甘草、枸杞、女贞子、黑芝麻对TNF-α、IL-10均表现出正向调节作用，提示这4味中药在提高酪氨酸酶活性，黑素细胞活力、黑素细胞增殖以及免疫细胞因子合成与释放中起到重要作用，可作为白癜风组方主要成分。实验同时发现，合欢皮、黑桑葚对TNF-α起着上调作用，旱莲草、黑桑葚使IL-10下降，出现负向作用，其作用机制不清，有待于深入研究。关联成像
中药作用机制与途径复杂，但某些中药可以通过免疫与炎症反应降低TNF-α浓度或使IL-10浓度增加而起到作用。笔者通过中药对TNF-α、IL-10免疫调理作用的研究将中药筛选，可为今后中药的有效组方选择提供可靠的依据，进而为提高白癜风的临床诊疗水平带来新的希望。
【相关文献】
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全叶青兰［3］，梁晓红，唐显华.细胞间黏附分子1和白介素10与白癜风的相关性［J］.中南医学科学杂志，2011，39（2）：173-175.
［4］张晓东，张国斌，张建新，等.自制红花复方制剂白癜风疗效观察［J］.人民军医，2013，56（4）：438-439.
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［6］Montes LF，Abulafia J，Wilborn WH，et al.Value of histopathology in vitiligo［J］.Int J Dermatol，2003，42：57-61.
［7］ Fenton JS，Bergstrom KG.Vitiligo：nonsurgical treatment options and the evidence behind their use［J］.J Drugs Dermatol，2008，7：705-711.
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