慢性阻塞性肺疾病患者IL-6%IL-8、TNF乙水平 王萌萌心於海洋12孙雨晴1程朋朋1汪倩1管雯斌3韩锋锋1
【摘要】目的研究慢阻肺患者炎症因子与支气管黏膜组织自噬作用之间的相关性。方法选取上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科20例慢阻肺患者和10例健康者，分为3组:A组(轻度+中度组)、B组(重度+极重度组)和对照组。采集血、肺泡灌洗液(BALF)、支气管黏膜组织°检测血清、BALF中炎症因子水平及支气管黏膜组织自噬作用。结果(1)与对照组相比，血清ILF、IL-8及TNF-f在A组无统计学意义，B组明显增高"IL-6P<0.05, II-8、TNF-f P<0.01)o BALF中A组和B组ILF水平均明显升高(P<0.05),B 组IF及TNF-f水平明显增高(TNF-f P<0.05，九-戸<0.001)；(2)与对照组相比,A组、B组中Atg5的mR-NA及Beclin1的蛋白表达在均显著低于对照组"P<0.01),L C3B的蛋白表达均显著降低(A组P<0.05,B 组K0.01)，而P62的mRNA及蛋白表达均显著增加(P<0.01)；(3)血清、BALF中儿-水平与支气管黏膜自噬作用呈负相关"r<0,P<0.01)。结论九-、！-、］"!-在慢阻肺的进展过程中明显升高。自噬作用在慢阻肺的进展过程中明显降低。IF水平的升高可能与慢阻肺患者自噬受损有关。 【关键词】慢性阻塞性肺疾病;ILF；ILF；TNFF；自噬
Correlation analysis of IL-6,IL乙and TNF乙with autophagy of bronchial mucosa*paheeSe with chronic obstnichve pulmonary disease
WANG Meng-fegV,YU Hai-yang1,SUN Yu-ying1,CHENG Peng-yeng1,WANG Qian1,GUAN Wee-fn,HAN Fengfeeng1
1. DepaCmeni o Respiratory Medicine；3.Depaiment o PatOoloo?Xinhua Hospital AffiOame m Shanghai Jiaotong Unuersito School o Medicine,Shanghai200092,China；
2.DepaCment o Respiratory MePicin£,Xuhut Hospital Zhoogshan Hospital Affiliated m Fudan University,Shanghai200031,China
(Abstract)Objective To explore the correlation between inflammatory factors and autophagy of bronchial mucosa in patients with chronic obstructive pulmonary disease"COPD).Methods It selected10cases of healthy subjectsand20patientswith COPD aeom theDepaetmentoaRespieatoeyMedicineoaXinhuaHospitaeAaieiated to ShanghaiJiaotongUnieeesitySchooeoaMedicine and theyweeedieided intotheconteoegeoup$thegeoup A(GOLD1 +GOLD2)$and thegeoup B(GOLD3+GOLD4)accoedingtotheseeeeityoadisease.Theieseeum$beonchoaeeeoeae eaeageaeuid
and beonchiaemucosaweeecoeected.Theeeeeesoainaeammatoeyaactoesweeedetected in seeum and BALF.The expressions of autophagy related genes and proteins were detected in bronchial mucosa.R esuUs(1) Compared with the control group,the levels of ILF,ILF and TNF-f in serum showe not statistical significance in the group A,but the-were significantly higher in the group B(ILF:P<0.05；ILF/TNF-(：P<0.01).In BALF, the level of ILF in the groups A and B increased significantg(P<0.05),and the levels of IL-8and TNF-f in the group B increased significangy(TNF-f：P<0.05；IL-8:P<0.001).(2)Compared with the control group,the etpeesion oaAtg5mRNAand Becein1peotein in thegeoupsAand Bwassigniaicanteyeoweethan thatin theconteoe geoup(P<0.01)$and thepeotein etpeesion oaLC3Bwassigniaicanteyeeduced(P<0.05in thegeoup A$P<0.01
doi:10.3969/j.issn.1009-6663.2021.07.007
基金项目：上海市自然科学基金资助项目(No.14ZR1426800)
作者单位：1.200092上海，上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科
2.200031上海，复旦大学附属中山医院徐汇医院呼吸科
3.200092上海，上海交通大学医学院附属新华医院病理科
通信作者：韩锋锋,E-mail:
in the yroup B),while the mRNA and protein expression of P62increased sivnificantla(1<0.01).(3)The levei of IT-8in serum and BALF were neaativela correlated with bronchiai mucosai autophayy(r<0,1<0.01).Conclusion IL-6,IT-8,and TNF-v increase sivnificantla duriny the provression of COPD.Autophagy is sivnificantla reduced duriny the provression of COPD.The increase of ILV levei may be related to the irnpaired autophayy in COPD patients.
(Key words]COPD；TV；TV；TNF-c；autophayy
慢性阻塞性肺疾病（Chronic Obstructive Pulmv-narg Diseesas,COPD，简称慢阻肺）是一种常见的慢性呼吸系统疾病，全球40岁以上发病率髙达9%+ 10%［1］o慢阻肺因其高发病率、高致死率和高经济负担的特点，现已成为严重的世界性公共卫生问题探究慢阻肺的发病机制，对研发其药物靶向具有重要意义。研究表明慢阻肺是一种全身炎症反应综合征，特别是急性加重期，包括CRP、ILV、ILV、IL-10、TNF-v在内的炎性介质均会升高⑶o同时也有研究表明自噬与慢阻肺的发生发展有着密切关系，我们的前期研究已发现慢阻肺患者肺组织自噬水平在轻、中度组增强，重度组减弱⑷。本文通过检测慢阻肺患者血清和BALF中炎症因子及支气管黏膜组织中自噬相关基因及蛋白的表达水平，分析其二者在慢阻肺疾病进展中的作用。
资料与方法
一、实验对象及分组
研究对象选自2016年6月1日至2019年10月1日期间收治于上海交通大学医学院附属新华医院呼吸科的慢阻肺稳定期患者以及同期健康体检者。本研究经过上海交通大学附属新华医院伦理委员会批准，并通过受试对象的知情同意。实验对象分为3组：慢阻肺患者分为A和B组,A组（轻度+中度组）5=12）、B组（重度+极重度组）（（=8），以及对照组（（=10），组间患者的性别比例和病情严重程度等一般资料比较差异均无统计学意义（1 >0.05）。其中，慢阻肺组诊断标准按照2017年慢性阻塞性肺疾病国际诊治指南［5］，依照肺功能检查评估气流受限严重程度，慢阻肺患者肺功能FEV/ FVC均<70%，轻度FEV1"80%预计值，中度50% !FEV1<80%预计值，重度30%!FEV1<50%预计值，极重度FEV1<30%预计值，将慢阻肺患者分为轻度、中度、重度、极重度（其中轻度（=6、中度（=6、重度（=7，极重度（=1）。排除已明确诊断以下疾病及禁忌症的患者：支气管炎，活动性，间质性肺疾病，肺栓塞，慢性血栓栓塞性肺动脉高压，严重肝、肾功能不全，严重心血管疾病，神经肌肉疾病，脑梗死或脑出血后遗症，有支气管镜检查禁忌症。
二、实验材料
TNF-a、IL-6、IL-8试剂盒购自Elabscienca公司。Atg5、P62引物合成（上海生物工程有限公司）、逆
转录试剂盒［TakaRa］。微管相关蛋白1轻链3（microtubuia associa-ted protein1lighi chainVB, LC3B）抗体、P62抗体购自Abeam,Beclin1抗体购自CST。GAPDH抗体、辣根过氧化物酶山羊抗兔（二抗）、辣根过氧化物酶山羊抗小鼠（二抗）购自碧云。
三、试验方法
1肺功能检测采用意大利科时迈肺功能仪（COSMED公司产）测定3组受试者的第一秒用力呼气量占预计值百分比（FEV/预计值％）、肺活量占预计值百分比（FVC/预计值％）、FEV1/FVC（%）。
2酶联免疫吸附法ELISA检测血清、肺泡灌洗液中炎症因子IL-6、IL-8、TNF-v于清晨空腹抽肘正中静脉血5mL，支气管电子内镜系统BF290（OLYMPUS公司产）下灌洗液5mL,2
无菌纱布过滤待离心，外周血及肺泡灌洗液均3800 r/min转速离心15min，取上清置于-80V冰箱保存待测。采用酶联免疫吸附法（ELISA）测定血清及肺泡灌洗液IL-6、ILV、TNF-清，所有操作严格按试剂盒。
3免疫组织化学染支气管镜下收集患者支气管黏膜组织约15my，操作按SABC免疫组织化学试剂盒说明进行。烘片、脱水、3%比。2灭活、抗原修复、5%牛血清清蛋白（BSA）封闭,30min后孵兔抗人LC3B抗体4V冰箱过夜，羊抗兔二抗室温孵育30min，加入试剂SABC室温孵育20min,DAB 显试剂盒显。苏木素复染、脱水、透明、封片，显镜下、照相。
4实时荧光定量r e al-tima PCR检测人肺组织
中Atg5、P62的mRNA 表达 支气管镜下收集患者
支气管黏膜组织约15 mg 与1 mL TGzol 相混合后放
入组织匀 中充分研磨,RNA 分离提取后，反向 转录成cDNA ，采用SYBR Green 以cDNA 为模板进
实时荧光PCR 反应；反应参数：95 V 30 s 1个循
指纹读取器
环,95 V 5 s,60 V 34 s 40 个循环,95 V 15 s,60 V 60 s ,15 s 1个循环,
目的基因的计算公式为
2-））Ct 。以GAPDH 为内参照，人GAPDH 上游引物
CAGGAGGCATTGCTGATGA ，下游弓 | 物 GAAGGCT- GGGGCTCATTT , Ag5 游引 物 TGGACAGTTG- CACACACTAGGA , 下 游 引 物 TCAGATGTTCACT-
CAGCCACTG ; P62 游 引 物 TGGCCATGTC-CTACGTGAAG ，下游 AGCCATCGCAGATCACATTG 。
5 Western blot 测定支气管黏膜自噬相关蛋白 Atg5、Becen1、LC3B 的表达支气管镜下收集患者
支气管黏膜组织约15 mg 与300 & y 液（RI-PA 裂解液：PMSF = 100 : 1）混合后加入匀浆器中， 充分研磨，转移入1.5mLEP 管超声粉碎，冰 解
30 min ，以14 000 r/min 离心20 min 后取上清，用
BCA 浓度测定试剂盒检测 浓度。
12% SDS-PAGE 凝胶80 V 电泳120 min ，转移至
PVDF 膜,5%脱脂奶粉封闭2 h , 一抗（1 : 1 000稀
释）孵 4 V 过夜。一抗 30 min ，二抗（1 :
1 000稀释）孵 40 ml ，光剂 像。 用
Image LabTM
灰度值分析。
、
采用 SPSS 22.0
,
采用均数±
（J±s ） ，多组
用单因素方差分析,SpeaGnanl 相关分析非正态
分布定 的相关性，应用GraphPad PGsm5统
制 ，P<0.05 为
。
结 果
—、实验 的一般性描述
A 组、
B 组
照组性别比例和病情严重程度
等一般 相比，性别 无
（P >
0. 05） ,A 组、B 组FEV/预计值％ 低于对照组
（P<0. 001）（见表 1）!
表1实验对象临床资料的一般性描述
目
照组
度+中度组重度+重度组F P
性别（男：女）4 : 68:4
5:3 1.731 *0.421年龄（岁）61.3 ±4.4566.60 ±8.9977.00 ±6.2012.320
<0.01
FEV 1 L
%
93.02±11.07
62.46 ±9.58
41.08 ±5.99
78.861<0.001
备注：*
为x 2值
二、人血清和肺泡灌洗液上清中IL-6、IL-8及 TNF-的表达
箱包手把
照组相比，血清炎 A 组
意义，B 组中IL-6、IL-8及TNF-（
高，有（IL-6 的 P < 0. 05, IL-8、TNF-的 P <
0.01）。 灌洗液 A 组IL-6
高，有统计学意义（P <0. 05 ）,B 组中IL-6、IL-8及TNF-
（
高， （IL-6 的 P<0.05,
IL-8 的 P<0. 001 ^TNF--的 P<0.05）（见图 1、2）。
、支气管黏膜组织免疫组化LC3B 照组相比,A 组、B 组患者支气管黏膜组织
的LC3B 蛋白表达量减少（见图3 ）。
图1血清炎症因子IL-6、IL-8及TNF q 的表达（与对照组比较，* P<0. 05, * * P<0.01
）
(_
E/
6d
)9
JI
一
图2肺泡灌洗液上清炎症因子IL乙、IL乙及TNF乙的表达（与对照组比较，* P<0.05,"K0.001）辐照杀菌设备
四、自噬相关基因Atg5、P62的mRNA表达对照组（其中A组、B组P<0.001）,P62在A
Real-time PCR分析Atg5在A组、B组、B组mRNA显著高于对照组（其中A组、B组P 组mRNA显著低于<0.001）（见图4）。
图3支气管黏膜组织LC3B蛋白免疫组织化学（HE t200）
a.对照组;
b.轻度+中度组;
c.重度+极重度组
i
-
i
3
usb转并口
集
Atg5P62
图4支气管黏膜组织Atg5、P62的mRNA基因表达
与对照组比较，$$$P<0.001
五、自噬相关蛋白Beclin1%P62%MAP-CC3*/I 的蛋白
Western blot分析结果显示，Beclin1在A组、B 组蛋白表达显著低于对照组（其中A组P<0.001,B组P<0.001）o P62在A组、B组蛋白表达显著高于对照组（其中A组P<0.001,B组P<0.001）。LC3B在A组、B组蛋白表达显著低于对照组（其中A组P<0.01,B组P<0.001）（见图5）
蛇板
。
Beclinl
P62
正常组轻度+中度组 重度+极重度组GAPDH
Beclinl P62LC3B
图5支气管黏膜组织BecIin1、P62、LC3B的蛋白表达
与对照组比较，**P<0.01,***P<0.001
六、炎水平与自噬作用的相关性分析
常对照组对比，随着重程度的--C3B蛋白表达量与血清IL-8水平呈负相关(r=-0.001,P<0.01)，灌洗液IL-8水平呈负相关(r=0.022,P<0.01),、肺泡灌洗液IL-6、TNF-水平无相关性(见2%3)o
表2血清炎症因子IL-6、IL-8、TNF-症
与LC3B蛋白表达量的相关性分析
数r P95%可信区间
II-60.0020.767(-0.010〜0.013)
TNF-(0.0300.103(-0.007〜0.068)
IL-8-0.0010.007(-0.002〜0.000)
表3肺泡灌洗液炎症因子ILQ、ILQ、TNF症
陶瓷手链
与LC3B白表量的关性分析
数r P95%信区
LL-6BALF0.0860.377(-0.115〜0.287)
TNF-(BALF0.4970.119(-0.144〜1.137)
LL-8BALF-0.0220.003(-0.036〜-0.009)
讨论
慢阻肺患者炎症的发生及发展与多种炎症细胞活化及炎和介质的释放有关，气和，对毒及气体的炎症反应增强是慢最主要的机制[5]!慢的慢性炎症主及气道、肺实质和 管，其中中性粒细胞、淋巴细胞以及巨噬细慢性炎症的发生和，这些细胞激活后释放包括IL-6、IL-8、TNF-在内的多种炎症介
[6]o IL-6是一种 多种生物活性的趋化，
激活和调节免疫细生理特性，可以通过B细胞的成熟，分泌IgG、IgE、IgA等细胞因子，从而诱导炎症反应多种的发生过程。慢患者IL-6和灌洗液中巨噬细胞、中性粒细胞水平显著升高[7]o IL-8是一种多细
胞源性的炎，多种生物效能，中性粒细IL-8 后生形态变化，胞内Ca+浓度升高脱，外周组胺释放引发炎症反应节疾病的关改变，IL-8对淋巴细胞、嗜酸性粒细胞和嗜碱性粒细一定
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