柱前衍生化HPLC 测定盐酸阿比多尔颗粒中有关物质二甲胺 王立立，张 云，张相军
（山东省药学科学院 山东省化学药物重点实验室，山东 济南 250101）
摘 要：目的 利用2,4-二硝基氟苯为柱前衍生剂，建立了用高效液相谱法测定盐酸阿比多尔颗粒中的有关物质二甲胺。方法 考察了反应温度、反应时间对衍生化反应的影响，确定最佳衍生反应条件：在60 ℃水浴中反应30 min 。采用Pinnacie DB C 18谱柱（150 mm × 4.6mm, 5um ）；流动相为乙腈-0.1 %磷酸溶液，梯度洗脱；检测波长为380 nm ；流速为1.0 ml/min ；柱温为30 ℃。结果 二甲胺在0.03~0.6 μg/mL 范围内线性关系良好（r =0.999 9）。定量限为0.30 ng ，平均加样回收率为99.98 %（n =9）。结论 本法准确、方便、快速，可用于盐酸阿比多尔颗粒中有关物质二甲胺的质量控制。 关键词：高效液相谱法；盐酸阿比多尔；二甲胺；柱前衍生化法
中图分类号：R917 文献标识码：A 文章编号：1672-979X （2018）04-0261-03DOI ：10.3969/j.issn.1672-979X.2018.04.006
Determination of Dimethylamine in Arbidol Hydrochloride Granules by HPLC after Pre-column Derivation
WANG Li-li, ZHANG Yun, ZHANG Xiang-jun
(Shandong Provincial Key Laboratory of Chemical Drug , Shandong Academy of Pharmaceutical Sciences , Jinan
250101, China )
Abstract: Objective To determine dimethylamine in Arbidol Hydrochloride Granules by high performance liquid chromatography (HPLC) with UV detection after pre-column derivatization with 1-fluoro-2,4-dinitribenzene (DNFB). Methods The effects of reaction temperature and time on the derivatization reaction were investigated and the optimum derivatization condition was reaction for 30 min in water bath of 60 ℃. Chromatographic separation was achieved on a Pinnacie DB C 18 column (150 mm ×4.6 mm, 5 μm). Gradient elution was performed, with acetonitrile-0.1 % phosphate solution as mobile phase. The detection wavelength was 380 nm and the flow rate was 1.0 ml/min. The column temperature was 35 ℃. Results The relationship between the dimethylamine concentration and the dimethylamine-DNFB peak area is linear in the range of 8-48 μg/ml (r =0.9999), and the average recovery was 99.78 %, with RSD of 1.27 %. Conclusion The method can be simple, rapid, accurate and reliable. It can be used for the quality control of dimethylamine in the Arbidol Hydrochloride Granules.
Key words ：HPLC; Arbidol Hydrochloride; dimethylamine; precolumn derivatization
收稿日期：2018-02-11
作者简介：王立立，硕士，从事新药研发工作 E-mail:
盐酸阿比多尔有干扰素作用，通过抑制流感病毒脂膜与宿主细胞的融合而阻断病毒复制，对具有A 、B 型抗原的流感病毒的抗病毒活性最显著；除具有杀灭病毒作用外，还有免疫调节作用，激活吞噬细胞，提高机体对病毒的抵抗能力；是用于A 、B 型病毒引起的流感和急性呼吸道病毒性感染的
新型抗病毒药物[1-3]。
二甲胺是盐酸阿比多尔的合成原料，在体内易与亚硝酸根反应形成致癌性的N-亚硝基胺毒性物质，从而对人体健康造成危害[4-6]。为了保证药品安全性，有必要对盐酸阿比多尔颗粒中的潜在杂质二甲胺进行控制。
食品与药品 Food and Drug 2018年第20卷第4期 261
1 仪器与试药
1.1 仪器
高效液相谱仪（Agilent 1260）；Mettler Toledo XS205电子分析天平（梅特勒-托利多）；DKB-2006低温恒温槽（上海精宏）；TGL-16gR离心机（上海安亭）。
1.2 试药
盐酸二甲胺对照品（批号：H1527047，纯度>99.0 %），2,4-二硝基氟苯（批号：20160702，梯希爱，纯度>99.0 %）均购自阿拉丁；盐酸阿比多尔颗粒（批号：160928、161102、170416，石家庄四药）；三乙胺（批号：20160203，国药集团化学试剂公司）；乙腈为谱纯，磷酸为分析纯。
2 方法与结果
2.1 谱条件
谱柱为Pinnacie DB C18（150 mm × 4.6 mm，5 μm）；流动相A为0.1 %磷酸溶液，B为乙腈，梯度洗脱；流速1.0 ml/min；检测波长：380 nm；柱温：30 ℃；进样量：10 μl。梯度洗脱程序见表1。
表1 梯度洗脱程序
时间/min流动相A/%流动相B/%
0~1060~3540~65
联络柜
10~1135~2565~75
不倒翁沙袋11~182575
2.2 溶液制备
2.2.1衍生试剂精密量取1 ml 2,4-二硝基氟苯置入100 ml量瓶，用乙腈溶解并稀释至刻度，临用现配。
2.2.2二甲胺对照溶液取盐酸二甲胺对照品适量，精密称定，加乙腈溶解并定量稀释制成浓度为5 μg/ ml（以二甲胺计）二甲胺对照品贮备液。精密量取该贮备液1 ml至10 ml量瓶，加入100 μl三乙胺和1 ml 生试剂，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度，摇匀，过滤，作为二甲胺对照溶液和系统适用性溶液。
2.2.3供试品溶液精密称取盐酸阿比多尔粉末适量（约相当于盐酸阿比多尔10 mg），置入10 ml量瓶，加5 ml乙腈，超声10 min后，加入100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度，摇匀，过滤。2.2.4空白溶液分别精密量取5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂至10 ml量瓶中，摇匀，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容至刻度。
2.3 方法学考察
2.3.1系统适应性分别取2.2项下空白溶液，对照溶液和供试品溶液，按2.1项下谱条件进样，二甲胺衍生物峰与距离最近的衍生试剂所产生的峰分离度大于1.5，理论塔板数以二甲胺衍生物计算不低于3000，满足定量要求。见图1。 2.3.2定量限精密量取二甲胺对照品贮备液60 μl置入10 ml量瓶，依次加入5 ml乙腈、100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀后，60 ℃加热30 min，冷却后用乙腈定容至刻度，摇匀，进样。按S/N=10计算定量限为0.30 ng。
2.3.3线性关系的考察取二甲胺对照品贮备液依次稀释，获得二甲胺浓度分别为0.03，0.05，0.1，0.2，0.4，0.5，0.6 μg/ml系列对照品溶液，按2.2项下对照溶液制备方法，2.1项下谱条件，分别进样，记录峰面积。以峰面积Y为纵坐标，以对照溶
t/min
A
口袋领域t/min
B
t/min
萌发菌
C
A. 空白溶液；
B. 对照和系统适用性溶液；
C. 供试品溶液
图1
盐酸阿比多尔颗粒谱图
262 食品与药品 Food and Drug 2018年第20卷第4期
液的浓度X（μg/ml）为横坐标进行线性回归，得回归方程为Y=167.59X – 0.4745，r=0.9999。车载mp3播放器
2.3.4精密度试验取2.2.2项下对照溶液，按2.1项下谱条件，连续进样6次，记录峰面积，二甲胺峰面积的RSD为0.6 %（n=6），结果表明方法精密度良好。
2.3.5重复性试验按2.2.3项下方法平行制备6份供试品溶液，按2.1项下谱条件进行测定，记录峰面积，计算二甲胺的含量平均值为0.023 %，RSD为
1.3 %（n=6）。
2.3.6中间精密度试验由不同实验人员采用相同操作方法，使用两台不同的高效液相谱仪，重复上述重复性项下试验，仪器A（Agilent 1260）、B （岛津20A）测得二甲胺的含量平均值为0.025 %，RSD为3.1 %（n=12）。电子管功放机
2.3.7耐用性试验通过改变流动相初始比例、0.1 %磷酸溶液的浓度、流速、柱温、波长、不同品牌的谱柱等参数的变化，系统适用性溶液的分离度均大于5.0，表明该方法的耐用性良好。
2.3.8加样回收率试验取批号为160928的供试品，精密称定（约相当于盐酸阿比朵尔10 mg），共9份，
置入10 ml量瓶，分别加入乙腈5 ml，超声10 min，每个量瓶中依次加入对照溶液0.8，1，1.2 ml 各3份，分别加100 μl三乙胺和1 ml衍生试剂，摇匀后，60 ℃加热30 min，冷却后，用乙腈定容。取续滤液进样，计算加样回收率。结果见表2。
2.4样品含量测定取本品3批（批号：160928、161102、170416），按2.2.3项下方法制备供试品溶液，按2.1项下谱条件进样测定，记录谱图，3批样品中二甲胺的含量分别为：0.023 %，0.021 %，0.025 %。
3 讨论
3.1衍生条件选择本试验验证了不同的水浴温度（50，60，70 ℃），不同的衍生时间（20，30，40 min），不同的三乙胺体积（80，100，120 μl）对衍生结果的影响，最后确定水浴温度为60 ℃时，加入100 μl三乙胺反应30 min最合适。
3.2本文制定的柱前衍生化-HPLC能准确地测定盐酸阿比朵尔中二甲胺的含量，方法简便，重现性好，为制剂的质量可控性提供了科学的检验方法。
参考文献
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表2 样品测定结果
样品含量
/μg
加入量
/μg
测得量
/μg
回收率
/%
平均
回收率
/%
RSD
/%
1 2.3207 4.016 6.321899.63
2 2.3115 4.016 6.3384100.27
3 2.3253 4.016 6.337199.90
4 2.3138 5.0207.3347100.02
5 2.3207 5.0207.322599.6499.980.25
6 2.3046 5.0207.3306100.12
7 2.3345 6.0248.3611100.04
8 2.3092 6.0248.322699.82
9 2.3161 6.0248.3609100.35
本刊侧重报道食品、药品领域中与营养、保健和健康密切相关的生物科技研究成果，包括新产品及新生物活性物质，新工艺和新技术，药理及功能实验，临床及人应用研究等。对于新产品、新技术的开发性研究论文给予优先发表。
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