摘要：单克隆抗体从问世到目前广泛应用于临床， 经历了一段曲折的发展历程，其中人源化抗体是一个重要的里程碑。鼠源性mAb由于可引起免疫反应而削弱其疗效，因而逐渐被人源化 mAb所取代，甚至出现全人mAb取代人源化 mAb的趋势。本文主要介绍了全人mAb的生产方法之一，转基因小鼠技术，并对该项技术的应用作了些展望。 关键词：单克隆抗体；人源化；转基因小鼠；Cre/LoxP
Abstract:After its advent, monoclonal antibody has gone an uneven way to its present wide applications in clinical practices, during which the humanized antibody set an important milestone. Murine mAbs are trended to be replaced by humanized mAbs or even human mAbs as murine mAbs’ immuno-side effects may reduce therapeutic effects. The paper briefly introduces tansgenic mice technology as one of generating human mAbs methods as well as share some prospects.
Key Words:Monoclonal Antibody(mAb); Humanization; Transgenic Mice; Cre/LoxP
一、单克隆抗体背景介绍
从1975年英国学者Milstein和德国学者Kohler利用小鼠骨髓瘤细胞和绵羊红细胞免疫的小鼠脾细胞融合[1]，形成了可产生单克隆抗体的杂交瘤细胞，该细胞既能产生抗体，又可无限增殖，从而创立了单克隆抗体杂交瘤技术。单克隆抗体在医学、生物学、免疫学等诸多学科中发挥了巨大的作用。
单克隆抗体不仅可用于分析抗原的结构及检验抗原抗体未知的机理关系，还可用于分离、纯化特定分子抗原，甚至用于临床疾病的诊断和等。 1989年Huse等首次构建了抗体基因库，从而使抗体研究从细胞水平进入到分子水平，并推动了第三代抗体-基因工程抗体技术的发展。
二、鼠源单克隆抗体的制备及其特性
鼠源性单抗的制备，一般程序为从超免疫的供体中即抗原免疫的小鼠，获取脾细胞，再与骨髓瘤细胞融合，最后对已筛选出的单个细胞进行鉴定和克隆，培养出能分泌单抗的克隆细胞。目前所生产的单抗大多数是鼠源性的，在临床应用方面还存在着很大的弊端，主要
是鼠源单抗与NK等免疫细胞表面Fc段受体亲和力弱，产生的抗体依赖性细胞介导的细胞毒作用(ADCC)作用较弱，而且它与人补体成分结合能力低，对肿瘤细胞的杀伤能力较弱，并且鼠源性抗体在人血循环中的半衰期短，它发挥ADCC作用的时间较短；其次鼠单克隆抗体还具有免疫原性，易使宿主引起过敏反应。这样，一方面降低了单抗的效价，另一方面又会给病人带来严重的后果。
鼠源性抗体作为异种蛋白应用于人体可引起免疫反应，产生人抗鼠抗体（human anti-mouse antibody, HAMA胸片数据库）[2]，很大程度上限制了mAbs 的临床应用。此外，鼠源性mAbs 不能与人类抗体FcRn 结合[3]。为了克服以上这些问题，鼠源性单克隆抗体还应进一步改善才能广泛应用于临床。
三、单克隆抗体药物的发展进程（图1自由草）
1975年，Kohler与Milstein通过杂交瘤细胞技术，获取了历史上第一株能分泌抗体且无限增殖的细胞。11年后，在1986年，FDA批准了第一例使用现代生物技术生产的性单抗药物Orthoclone OKT3（鼠源单抗-CD3），这个药物可用于器官移植产生的急性排异症。
8年后，FDA及生物学界已经意识到使用于患者的鼠源抗体所引发的免疫原性，其能导致迅速降解、药效下降以及提高排异反应的风险。因此基于这样的负面作用，生物技术和医药公司着力于使用分子生物技术工具来改造并获取低免疫原型的抗体。鼠源抗体被进行体外基因改造，形成嵌合型单抗。
又过了3年，FDA批准了首例使用CDR植入抗体技术生产的药物Zenapax。
到了2002年，FDA批准了噬菌体展示技术所获得的单抗Humira。
可惜的是，截止至2005年，FDA尚未批准使用转基因技术生产人源抗体的药物。早在1985年，Alt等人就设想使用转基因技术能帮助生产人源序列的单克隆抗体。1989年，Bruggemann等人发表保留人重链部分的转基因单抗。1994年，Green等人发表了使用胚胎干细胞技术，编码重链以及kappa轻链基因并使其人源化。
图1
四、抗体人源化
人源化抗体（humanized antibody）又称互补决定区移植抗体 ，是指抗体的可变区部分（即Vh和Vl区）或抗体所有全部由人类抗体基因所编码（图2）。
图2
人源化抗体包括嵌合抗体、改型抗体、表面重塑抗体和全人源化抗体等。
嵌合抗体是利用DNA重组技术，将异源单抗的轻、重链可变区基因插入含有人抗体恒定区的表达载体中，转化哺乳动物细胞表达出嵌合抗体，这样表达的抗体分子中轻重链的V区是异源的，而C区是人源的，这样整个抗体分子的近2/3部分都是人源的[4]。
改型抗体也称CDR植入抗体(CDR grafting antibody)，抗体可变区的CDR是抗体识别和结合抗原的区域，直接决定抗体的特异性。将鼠源单抗的CDR移植至人源抗体可变区，替代人源抗体CDR发动机散热器，使人源抗体获得鼠源单抗的抗原结合特异性，同时减少其异源性[5]。
表面重塑抗体是指对异源抗体表面氨基酸残基进行人源化改造。该方法的原则是仅替换与人抗体SAR差别明显的区域，在维持抗体活性并兼顾减少异源性基础上选用与人抗体表面残基相似的氨基酸替换。所替换的片段不应过多, 对于影响侧链大小、电荷、疏水性, 或可能形成氢键从而影响到抗体互补决定区构像的残基尽量保留胞苷酸[6]。
全人源化抗体是指将人类抗体基因通过转基因或转染体技术，将人类编码抗体的基因全部转移至基因工程改造的抗体基因缺失动物中，使动物表达人类抗体，达到抗体全人源化的目的。目前，已建立多种方法生产完全人源性抗体超导无轴陀螺空天载具[7]，主要有噬菌体展示技术、转基因小鼠技术、核糖体展示技术和RNA-多肽融合技术。仿皮绒
五、转基因小鼠技术
转基因小鼠技术关键在于转基因小鼠的构建工作，主要的方法有胚胎干细胞（ES细胞）
法、逆转录病毒感染法、体细胞核移植法、精子载体法、YAC法（人工酵母染体法）和BAC法（人工细菌染体法）等多种方法。
Lonberg于1994年建立出表达人免疫球蛋白的转基因小鼠，从此以后，人源性抗体便可由动物制备[8]。该技术是将人抗体基因微位点转入小鼠体内， 产生能分泌人抗体的转基因小鼠。其前提是人的抗体基因片段在小鼠体内进行重排并表达，并且这些片段能与小鼠细胞的信号机制相互作用，即在抗原刺激后，这些片段能被选择、表达并活化B细胞分泌人抗体[9]。1998 年，Green 等[10]将人抗体轻重链基因构建成酵母人工染体（yeast artificial chromosome, YAC），通过基因打靶技术将其转入自身抗体基因位点已被灭活的小鼠基因组中，通过繁殖筛选，建立分泌高亲和力人抗体的小鼠品系，Mendez 等[11]采用细胞融合法， 将YAC的酵母细胞与鼠胚干细胞（ES）融合，将整合有目的基因的ES 细胞导入小鼠囊胚，形成嵌合体小鼠，通过反复筛选，最后获得分泌完全人抗体的转基因小鼠，再用传统的杂交瘤细胞技术，将产生人抗体转基因鼠的B细胞与骨髓瘤细胞融合，获得能够分泌高亲和力的人源抗体的瘤细胞系。转基因小鼠产生由多个同源V 基因片段编码的单克隆抗体，抗体的活性能够大大的增强。至目前为止，已经有三十多个由转基因小鼠制备而来的
抗体已投于临床实验中，其中至少有5个已在临床三期阶段[12]。虽然如此，但是该技术至今还未发展完全，其转基因片段较小，且相邻基因片段高度同源，重组过程复杂，在面对抗原多样性时，无法完全产生相应的抗体。随着免疫学技术和分子生物学等的发展，将会有越来越多的人源性抗体用于临床试验之中，从而促进靶向药物的发展。
转基因小鼠制备人抗体的优点是，其功效优于其它生产抗人蛋白单抗技术。不足之处在于（1）由于抗体是在小鼠体内装配，因而产生的单抗具有鼠糖基化模式，所以这些单抗最终并不是全人的；（2）转基因通常有体细胞突变和其它独特的序列，导致不十分完全的人序列；（3）转基因小鼠表达的人Ig多样性较少, 而且在同一小鼠中不能够产生IgG各亚类； ( 4) 由于转基因小鼠片断较小，仅有30Kb，使抗体应答不足以满足抗原具有多样性[13]。
六、转基因小鼠分离人单抗平台
Abgenix公司的XenoMouse和XenoMax是人源抗体技术，它们使用转基因小鼠获取制取性单克隆抗体。XenoMouse是一种小鼠抗体表达基因被人源抗体基因所替代的转基因小鼠。XenoMouse这个品系的转基因小鼠已经用于制备多个高亲和力、全人源化抗体（已进
行至临床阶段）以用于检测复合型疾病。然而小鼠免疫系统的剩余部分则被全部保留下来，工程小鼠大约80%人类抗体重链的基因以及绝大部分轻链基因。Abgenix公司开发多个品系的XenoMouse以满足不同种类抗体用在不同功能性中。
Medarex公司的UltiMAb平台使用转基因小鼠，转基因小鼠的基因被改造成人源的，从而使基因表达人类抗体。该技术凭他包括三个关键抗体技术，它们Medarex’s HuMAb-Mouse技术、Kirin Brewery’s TC Mouse技术和KM-Mouse技术（前两种技术特性的结合体）。对于Medarex’s HuMAb-Mouse技术的转基因小鼠，鼠抗体编码基因失活并被人抗体编码基因所取代。这些人源基因编码非重组人类抗体的重链和轻链。而Kirin’s TC Mouse技术则是转基因小鼠含有全套在人类免疫球蛋白的可变和恒定区域基因。因为小鼠的核糖体已被失活且被人源核糖体的编码基因所替代，TC小鼠技术甚至能制备所有抗体亚型。综合了Medarex和Kirin这两种重要特性，便有了KM-Mouse技术，其已经形成一个能生产广谱抗体的平台，原因在于其拥有100%人类核糖体来编码抗体基因。尤其是，制备不同亚型的能力，使得设计型单克隆抗体时变得更具适应性，理由是特别的亚型决定其促使的免疫反应的影响和功能[14]。
大量文献描述了从转基因小鼠平台获取的人单抗及其特性。多种抗原，通过转基因小鼠，制备出各自的单克隆抗体，包括小分子抗原、编码病原体的蛋白、多糖抗原、隐性人类蛋白、细胞表面蛋白以及与人类肿瘤相关的糖基化突变体。大部分通过转基因小鼠获得的单克隆抗体结合力在0.1-10nM的范围内。然而，也有些转基因鼠单抗能达到皮摩尔级或者次皮摩尔级，例如Villadsen等人在2003年描述达到10pM的IL-15抗体、Wang等人在2005年发现4pM类胰岛素生长因子接受体以及Rathanaswami等人在2005年发表若干个在1-10pM范围内的IL-8单克隆抗体[15]。
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