免疫组化操作步骤
碳氟化钾（一）、仪器设备
1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.
2. 水浴锅
（二）、试 剂
1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl 2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L.
2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。
3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O，用10mmol/L NaOH调至ph8.0，加水至1000ml.
4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至ph8.0, 加水1000ml。
5. 酶消化液：a. 0.1%胰蛋白酶：用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。b.0.4%胃蛋白酶液： 用0.1N的HCl配制。
6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制
7. 风裱剂：a. 甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（ph9.0-9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制
8．TBS/PBS PH9.0-9.5，适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本
（三）、操作流程
1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。 a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟，更换二甲苯后在浸泡10分钟
b 无水乙醇中浸泡五分钟
c 95%乙醇中浸泡五分钟
d 75%乙醇中浸泡五分钟
2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片： A 抗原热修复
a 高压热修复 在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。将玻片置于金属染加上，缓慢加压，是玻片在缓冲液中浸泡五分钟，然后将盖子锁定，小阀门将会升起来。10分钟后除去热源，置入凉水中，当小阀门沉下去后打开盖子。此方法适用于较难检测或核抗原的抗原修复。 b 沸热修复 电炉或水浴锅加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至95℃左右，放入组织芯片加热10-15分钟。 c 微波炉加热 在微波炉里加热0.01枸橼酸钠缓冲液（ph6.0）至沸腾后将组织芯片放入，断电，间隔5-10分钟，反复1-2次。适用的抗原： Bcl-2.Bax.AR.PR.C-fos.x-jum.z-kit.c-myc.E-cadherin. ChromograninA.Cyclin.ER.Heatshock.Protein.HPV.Ki-67.MDMZ.P53.P34.P15.P-glycoprotein.PKC.PCNA.ras.Rb.等
B 酶消化方法 常用0.1%胰蛋白酶和0.4%胃蛋白酶液。胰蛋白酶使用前预热37℃，消化时间约为5-30分钟。适用于被固定遮蔽的抗原：包括 Collagen.GFAP. Complement.Cytokeratin.C-erB-2.LCA.LN.等
铝型材滑轨3、免疫组化染SP法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2-3次各5分钟
（3）3%H2O2(80%甲醇)滴加在TMA上，室温静置10分钟
（4）PBS洗2-3次各5分钟
tokyo hot n0808
（5）抗原修复
（6）PBS洗2-3次各5分钟
（7）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（8）滴加Ι抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（9）4℃过夜后需在37℃复温45分钟
（10）PBS洗3次每次2分钟
（11）滴加Ⅱ抗45-50μl，室
温静置或37℃1小时
（12）Ⅱ抗中可加入0.05%的 tween-20.
（13）PBS洗3次各5分钟
（14）DAB显5-10分钟，在显微镜下掌握染程度
（15）PBS或自来水冲洗10分钟
（16）苏木精复染2分钟，盐酸酒精分化
（17）自来水冲洗10-15分钟
（18）脱水、透明、封片、镜检。
4、SABC法
（1） 脱蜡、水化
（2）PBS洗2次各5分钟
（3）用蒸馏水或PBS配制新鲜的3%H2O2，室温封闭5-10分钟，用蒸馏水洗3次
（4）抗原修复
（5） PBS洗5分钟
（6）滴加正常山羊血清封闭液，室温20分钟，甩去多余液体
（7）滴加Ι抗50μl，室温静置1小时或4℃过夜或37℃1小时
（8）PBS洗3次各2分钟
（9）滴加生物素化Ⅱ抗，20℃-37℃ 20分钟
（10）PBS洗3次各2分钟
（11）滴加试剂SABC 20℃-30℃ 20分钟
（12） PBS洗4次各5分钟
（13） DAB显：试剂盒或自配显剂显
（14）脱水、透明、封片、镜检。
免疫组化问题解答
1、染过强
原因 解决方法
a 抗体浓度过高或孵育时间过长 降低抗体滴度、抗体孵育时间：室温1小时或4度过夜 b 孵育温度过高超过37度 一般在室温20-28度
c DAB显时间过长或浓度过高 显时间不超过5-12分钟，以显微镜下观察为准
2、非特异性背景染
原因 解决方法
a 操作过程中冲洗不充分 每步冲洗3次每次5分钟
b 组织中含过氧化物酶未阻断 可再配置新鲜3%H2O2封闭孵育时间延长
c 组织中含内原性生物素 正常非免疫动物血清再封闭
d 血清蛋白封闭不充分 延长血清蛋白封闭时间
3、染弱
原因 解决方法
a 抗体浓度过低、孵育时间过短 提高抗体浓度、孵育时间不能少 于60分钟
b 试剂超过有效使用时间 应更换试剂
c 操作中添加试剂时缓冲液未沥干 每步滴加试剂前沥干切片中多余的缓冲液
使试剂稀释 （应防止切片干燥）
d 室温太低 低于15度 要改放在37度孵育箱孵育30-60分钟或4 度冰箱过夜
e 蛋白封闭过度 封闭不要超过12分钟
4、染阴性
原因 解决方法
a 操作步骤错误 应重试 设阳性对照
b 组织中无抗原 设阳性对照以验证试验结果
c 一抗与二抗种属连接错误 仔细确定一抗二抗种属无误
三步法（SP系列），实验步骤使用说明：
SP9001（兔）适用于兔来源的一抗
SP9002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗
SP9003 （山羊） 适用于山羊来源的一抗
SP9000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
3.0ml- 价格 ￥230.00 / 6.0ml- 价格 ￥380.00 / 18ml- 价格 ￥1080.00
试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年
一﹑试剂盒内容
试剂1 封闭用非免疫的驴血清工作液（含10%驴血清） 即用型
试剂2 生物素化二抗（驴抗兔/鼠/山羊） 即用型
试剂3 链酶卵白素-碱磷酶轭合物 即用型
试剂3 过氧化物酶标记链酶卵白素 即用型
实验步骤简介：
1. 细胞爬片：冷丙酮或4%的多聚甲醛固定的细胞爬片，置0.1mol PBS 室温10分钟复水。
双面自粘防水卷材
2. 修复：滴加复合消化液（0.125胰蛋白酶% +0.1胃蛋白酶%+0.01 EDTA% ）（ 0.1molPBS配制）4度30-40分钟 0.1mol PBS 洗三次，每次一分钟
3. 血清封闭：（试剂1）室温 10分钟，倾去。
4. 一抗：37℃ 1小时或4度过夜
5. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟陶瓷滤波器
6. 相应的生物素化二抗（试剂2）37℃ 30-40分钟
7. 0.1mol PBS 洗三次------每次三分钟
8. 链酶卵白素-碱磷酶轭合物或过氧化物酶标记链酶卵白素（试剂3） 37℃ 40分钟
9，NBT/BCIP或DAB显，切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果
用AEC显，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。
灏洋生物 15:14:49
名称 ：connexin 43
产品编号 ：CM7269
价格/规格：0.1ml/20ug
技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig分类：IgG2a
适用组织 ：冰冻/石蜡
阳性部位：细胞浆
组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）
产品说明 ：
产地: Cellscience
二步法（无生物素PV6000系列），
实验步骤使用说明：
试剂盒组成
试剂A: 3% H2O2
试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）
PV6001（兔）适用于兔来源的一抗
PV6002（小鼠）适用于小鼠来源的一抗
PV6000 (通用型) 适用于兔，小鼠，大鼠来源的一抗
3.0ml- 价格 ￥300.00 / 6.0ml- 价格 ￥580.00 / 18ml- 价格 ￥1780.00
试剂盒规格及贮存条件
规格：3ml（50片）/6ml(120 片)/18ml(360 片)
贮存条件：本试剂盒宜4℃保存，稳定期1 年
免疫组化染步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃
过夜，建议参见每种抗体的说明书。
x射线探测器5. PBS冲洗3x5`。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵
育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用
说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可
用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
8. 如果用DAB显，则切片经梯度酒精脱水干燥，(二甲苯透明)，中性树胶封固；如果
用AEC显，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。封片。
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技术指标 ：小鼠抗人，大鼠，小鼠 单克隆抗体 Ig分类：IgG2a
适用组织 ：冰冻/石蜡
阳性部位：细胞浆
组织处理：0.1mol枸橼酸缓冲夜-热修复15分钟（95度）
产品说明 ：
产地: Cellscience
二步法（无生物素PV6000系列），
实验步骤使用说明：
试剂盒组成
试剂A: 3% H2O2
试剂B: Polymerized HRP-Anti Mouse或Rabbit IgG 3.0ml/6.0ml/18ml（根据一抗宿主而定）
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免疫组化染步骤
1. 石蜡切片脱蜡和水化后，用PBS(pH7.4)冲洗三次，每次3分钟（3x3`）。
2. 根据每一种抗体的要求，对组织抗原进行相应的修复。
3. 如果有必要，每张切片加1滴（试剂A）室温下孵育10分钟，以阻断内源性过氧化物酶的活性。
PBS冲洗3x3`。
4. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl的第一抗体(用户自选)，室温下孵育60分钟或4℃
过夜，建议参见每种抗体的说明书。
5. PBS冲洗3x5`。除去PBS液，每张切片加1滴或50μl酶二抗聚合物(试剂B)，室温下孵
育40分钟或37度孵育30分钟或4度过夜。PBS冲洗3x3`。
6. 除去PBS液，每张切片加1滴或50μl新鲜配制的DAB或AEC溶液（详见DAB或AEC使用
说明书），显微镜下观察3-5分钟（DAB）或10分钟（AEC）。
7. 自来水冲洗，苏木素复染，若有必要，可用0.1%HCl分化，自来水冲洗，PBS返蓝。
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用AEC显，则切片不能酒精脱水，而直接用水性封片剂。封片。
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