【摘要】目的检测不同年龄大鼠下丘α-氨基羟甲基恶唑丙酸 水貂肉（α-amino-3-hydroxy-5-methyl-4-isoxazole-propionic acid, AMPA）受体亚型GluR2/3（Glutmate recptor 2/3）的分布及其与听性脑干反应（auditory brainstem response，ABR）的关系。方法分别测定1，4，9，15周龄SD大鼠ABR反应阈；FITC标记免疫组化方法检测GluR2/3亚型在不同周龄SD大鼠下丘中的分布。结果1周龄SD大鼠检测不到明显的ABR波形，4周龄起能检测到稳定的ABR波形。GluR 2/3在不同年龄大鼠下丘神经元中均有表达。1周龄大鼠染较少，位于胞膜；4周龄时表达强，主要位于胞膜；9周龄时较弱，位于胞膜及胞质；15周龄时可见于胞膜及核周胞质，但胞质较强。4周龄与1、9、15周龄胞膜相比，GluR2/3亚型的表达较强，差异有显著性；1周与9周、15周龄胞膜之间，GluR2/3的表达较弱，差异无显著性。结论出生后GluR2/3在下丘的含量及分布部位均随年龄变化而变化，这种改变可能与下丘的发育相关。 【关键词】谷氨酸受体；听性脑干反应；下丘
GluR2/3 expression in inferior colliculus of different aged SD rats
GAO Shang1,JIN Xiao-jie2
1Department of Otolaryngology, the Third Renmin Hospital, the Medical College of Shanghai
甲基化引物设计Traffic University, Shanghai 201900, China
2Department of Otolaryngology-Head-Neck Surgery, the Renji Hospital, the Medical College of
Shanghai Traffic University，Shanghai 200001，China
Ｃorrespononding author: GAO Shang, Email: **********************
【Abstract】Objective To investigate the expression of AMPA receptor subunit proteins GluR2/3 in the postnatal rat inferior colliculus (IC), and the relationship with the auditory brainstem response（ABR）. Methods The thresholds of ABR of different age SD rats were recorded respectively, and the expression of GluR2/3 in IC was detected with FITC-immunocytochemistry. Results P1w （the first postnatal week）SD rats did not show ABR wave which was appeared in the P4w rats, and there was no significant difference in the ABR thresholds among P4w , P9w and P15w rats. GluR2/3 was expressed in all sorts of neurons of IC in every postnatal groups and the expression in
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P4w rats was stronger than that in P1w, P9w and P15w rats. The immunostaining in IC in neurons of P1w and P4w rats was located mainly in the cell membrane, and in both the cell membrance and cytoplasm of P9w rat IC neurons, while in the cytoplasm of P15w rat IC neurons majoritily. Conclusio
n The different expression and distribution of GluR2/3 in the IC of different age rats may be involved in the development of auditory centre.
【Keywords】GluR2/3；Auditory brainstem response；Inferior colliculus车载硬盘
AMPA受体是离子型谷氨酸受体之一，是中枢神经系统兴奋性突触后膜最重要的组份，参与突触传导和突触可塑性。AMPA受体是由GluR1-GluR4（谷氨酸受体）四个亚型组成的同聚体或异聚体复合物，每个复合物包括4 ～5个亚型[1]。在中枢神经系统中，多以GluR2/3的形式存在。已证实GluR1通过C末端丝氨酸残基磷酸化，增强AMPA受体单通道电流，诱导长时程增强（LTP）产生。GluR2决定AMPA受体的钙通透性，含GluR2亚型的AMPA受体对Ca2+不通透，具有外向整流作用，由GluR1、3或4组成的AMPA 受体对钙离子具有通透性及内向整流作用，所以GluR2亚型的分布对于AMPA受体介导的信号传导具有重要意义［2］。
将GluR1/4 与GluR2/3受体亚型分开建立亚型特异性研究，发现AMPA受体有两条独立的调节机制——构成性通路及维持性通路。前者可瞬时激活，有助于记忆的形成；后者是突触上已有受体的重新分布，有助于记忆的维持。
以往的研究表明，AMPA受体在中枢神经系统的发育过程及可塑性中起重要作用，其各亚型分布及含量亦随神经中枢的发育而变化。在哺乳动物听觉神经系统中AMPA受体有其特异性表达和功能特性。但由于受检测条件的限制，AMPA受体在哺乳动物听觉神经系统中的表达尚无定论。其中在哺乳动物蜗神经前核和蜗螺旋神经节神经元［3］、外侧丘系［4］的表达情况的研究已有一定进展，在听觉通路其他位置的表达情况尚有争议。本实验用免疫组化方法研究GluR2/3在不同年龄SD大鼠下丘的表达，以求对听觉中枢功能发育的分子机制提供可能的形态学依据。 1材料与方法
1.1动物准备
体外碎石机1.1.1动物选择：分别取1，4，9，15周龄SD大鼠（由中科院上海实验动物中心提供，本院实验室饲养）各4只，雌雄、体重不限。
1.1.2ABR反应阈测定：动物麻醉后置于隔音屏蔽室内进行ABR检测。屏蔽耳机给声，耳机距被测耳约1 cm，刺激声为0.1 ms电脉冲激发的交替短声（click），刺激速度为19次/s，刺激强度为27.5 ～97.5 dB SPL，自动给声，带通滤波为100 ～3 000 Hz，增益105，叠加500次，记录电极置于两侧耳廓连线的颅顶正中，参考电极及接地电极分别置于同侧及对侧乳突，依次记录每只大鼠的ABR反应阈。
1.1.3取材：将测好ABR反应阈的大鼠固定于操作台上，快速心脏灌注0.9% 生理盐水至右心耳流出液体清亮为止，改用4% 多聚甲醛0.1 mol/L PBS液缓慢灌注（2 ml/min）至大鼠头颈变硬。剪开颅骨，取出脑组织，投入相同的固定液中后固定4 ～6小时，再移入30% 蔗糖溶液中至沉底。取出组织块，定位下丘，石蜡包埋。
1.2免疫染
地下室排水沟自头向尾侧作连续冠状切片，片厚5 μm，每隔4张取1张。切片共分三组，分别用于免疫染，尼氏染及空白对照。一抗为2.5 μg/ml兔抗鼠GluR2/3（Upstate公司产品），空白对照组一抗改为10% 正常山羊血清，余步骤同免疫染。
1.3结果判断
所有免疫反应切片均在荧光显微镜下进行评价，标本的细胞膜、细胞浆中出现黄绿的荧光即为阳性。尼氏染标本在光学显微镜下观察，胞浆中出现尼氏小体，呈深蓝，胞核呈淡蓝。
1.4显微图像分析
采用德国Leica Qwin 图象处理与分析软件进行图象分析。于每个视野内随机截取相同大小的面积，测定该视野内所有阳性神经元胞膜荧光灰度值，该荧光灰度值－背景灰度值即为该测量点的最终灰度值。
1.5统计分析
采用单因素方差分析（ANOVO），比较GluR2/3在不同年龄大鼠下丘中的表达。所有统计均在SAS软件（SAS6.12版，美国SAS软件研究所）下完成。
2结果
2.1ABR阈值检测结果
1周龄SD大鼠未引出ABR波形。4周、9周和15周龄SD大鼠波形基本相同，依次为Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ排列的一组波（表１）。
2.2尼氏染结果
光学显微镜下见大鼠下丘神经元丰富，尼氏小体位于胞质内，呈深蓝，胞核呈淡蓝。其中中央核（centor nucleus of inferior colliculus，ICC）及外皮层（external cortex of inferior colliculus，ICX）细胞较大，多为中等大小或大细胞。背皮层（dosal cortex of inferior colliculus，ICD）及ICC背侧细胞较ICX及ICC腹侧细胞小，多为小细胞。1周龄大鼠下丘神经元数量较多，大小较均匀，细胞形态单一，呈小圆盘状，神经元突起可见，但较短且少，细胞排列杂乱，境界不清。随着年龄增长，至4周
龄时神经细胞形态逐渐多样，细胞体积增大，数量减少，细胞间较分散，境界清晰，并出现较长的突起，这在9周及15周龄大鼠中表现更明显（图1 ~ 3）。
2.3免疫荧光染结果
1周龄大鼠下丘神经元GluR2/3染较4周及9周龄明显为淡，染杂乱，境界不清，ICD处主要位于胞膜，ICC处部分细胞可见荧光位于胞质，但突起上未见染。4周龄染主要位于胞膜，深，胞质未见荧光染，少量神经元突起上有染。9周龄时部分细胞染主要位于胞膜，亦有部分细胞染主要位于胞质。15周龄大鼠下丘神经元胞膜、胞质及突起上均可见苹果绿的荧光，但核周胞质染强，胞膜及突起上染淡。各神经元之间
及同一神经元胞膜上染深浅不一。生后4周与1周、9周、15周胞膜相比，GluR2/3表达较强，差异有显著性（Ｐ＜0.05），生后1周、9周、15周之间，差异无显著性（P ＞0.05），见图4 ~ 7和表１。所有空白对照组均未见免疫荧光染。
3讨论
AMPA受体是脊柱动物中枢神经系统主要的兴奋性神经递质受体。在正常的兴奋性突触传递过程中，突触前囊泡释放谷氨酸，作用于突触后膜的AMPA受体和NMDA受体。但由于NMDA受体上Mg2+的阻
滞，只有AMPA受体使Na+、K+单价阳离子通过，形成内向电流，产生突触后膜去极化，诱发快速的兴奋性突触后电位，参与兴奋性突触传递。
下丘为听觉中枢通路的重要中转站，与通路上下神经核团有广泛的纤维联系，在声刺激引起的与学习和记忆有关的前脑回路的形成中起重要作用。在下丘内部的神经发生有一时间坡度［5］，这一坡度与最佳频率表现即耳蜗音位的坡度一致。下丘的听觉整合功能与AMPA受体有密切关系。电刺激外侧丘系所诱发的兴奋性反应包含两种组分，一种为AMPA 受体介导的早期快速的反应，可以被AMPA受体拮抗剂CNQX或NBQX选择性的调节；一种为NMDA（N-甲基-D-门冬氨酸，N-methyl-D-aspartate）受体介导的慢反应，被NMDA 受体拮抗剂CPP或APV调节，体内试验证实AMPA受体和NMDA受体参与了听觉敏感性全部动态范围的反应［6］。Wu SH等［7］用膜片钳技术记录电刺激后ICC内神经元兴奋性突触后电流（EPSC），所有检测细胞于强直刺激后均产生LTP及长时程抑制（LTD），且LTP幅度随细胞内Ca2+ 浓度及刺激强度增加而增加，使用AMPA及NMDA受体拮抗剂后降低，认为LTP为听觉形成及听觉信息处理的细胞内机制。电刺激阿米卡星致聋的新生鼠一侧耳蜗，可引起双侧下丘所有AMPA受体flop型的短期增加［8］；AMPA注入一侧下丘，可诱导出听性癫痫，而AMPA受体拮抗剂可阻止癫痫的发生［9］；听性癫痫时GluR2含量下降及钙通透性AMPA受体亚型的增加［10］，这些都证明在正常或病理状态下声刺激引起的兴奋性突触的功能改变及听觉发育过程中，AMPA受体都起着关键性作用。
本次实验结果从形态学上证明AMPA受体亚型GluR2/3在下丘神经元的广泛分布，且不同周龄大鼠的含量不同。1周龄时含量少，主要分布于神经元胞膜；4周龄时最多，染最强，亦主要分布于胞膜，胞质中少见，但在ICD及ICX部分可见于胞膜及胞质；9周、15周龄时胞膜含量降低，与1周龄时无明显差异，但胞质含量增加，至15周时主要位于核周胞质。这与ABR阈值结果基本相对应，因为1周龄大鼠未检测到ABR波形，即其听觉中枢可能尚未发育完善，而4周龄大鼠Ⅳ波已出现，ABR阈值与9周，15周龄相比已无明显差异。说明随着年龄的增长，听觉通路各级神经元及神经纤维逐渐发育，神经元间的联系逐渐增强，神经纤维对刺激的反应逐渐同步，突触递质的释放逐步集中，GluR2/3的表达也逐步增加；直至成熟后，听觉神经系统已基本发育成熟，突触联系已基本建立，该受体的表达又逐渐下降。通常认为在某个大量形成突触的时期，谷氨酸受体的表达达到高峰，随后急剧下降，并伴有突触联系的改建。Joshi等［11］使用全细胞膜片钳技术记录小鼠斜方体内侧核突触前末端和突触后主要神经元的EPSCs变化，NMDAR调节的EPSCs直到P11／12（出生后11/12天）才增加，在P16又下降到极低甚至不能检测到的水平，同时AMPA
受体调节的EPSCs在P11／12时大约有三倍增长，这些变化亦提示发育过程中突触后膜谷氨酸受体在数量和动力学方面均发生了巨大的变化。
神经科学研究还表明，包含GluR2亚单位的AMPA受体亦随着突触发育逐渐增加，直至成熟，本研究结果与之基本相符［12］。但Caicedo［4］则认为随着听力的发育，GluR2的表达有下降趋势，而Gl
uR3则上升，这与GluR2阻止Ca2+ 通透而GluR3允许Ca2+ 通透有关。因为Ca2+ 的内流影响着中枢听觉系统的发育。如用不同的声刺激作用于初生的小鼠，激活不同的谷氨酸受体，产生不同类型的钙离子反应，可造成外侧上橄榄体不同的发育模式[13].
通常认为受体位于突触膜才具有功能，胞质内的受体往往与受体的循环与转运有关。我们推测幼年时或受刺激后神经细胞的可塑性较大，需要建立大量的突触联系，故AMPA 受体多位于胞膜上；成年后可能通过受体的内吞、突触内外的转移等多种因素将受体转移至胞浆内，如高尔基体，内质网，棘器等[14]，这部分受体在突触传递中暂不起作用，但在受刺激后可再次活化。事实上，AMPA受体的分布处于动态变化之中，在神经细胞内，受体存在着两个循环[15］：一方面，该受体不断地被锚定到突触后膜上，然后又通过胞饮作用进入到细胞内，如此往复循环，介导神经信号的传导；另一方面，单个神经细胞中各个突触之间不断进行受体交换，即受体不断地从一个突触转移到另一个突触。
我们还观察到下丘不同神经元之间及同一神经元胞膜上染深浅不一，可能与神经元的不同类型有关。根据神经元放电方式的不同，可将下丘神经元分为（sustained-regular, onset, buildup-pauser, rebound-regular, rebound-adapting, rebound-transient），不同的细胞类型对K+ 通透性不同[16]，实验证实，AMPA受体更容易引起onset，sustained型神经元对声刺激的反应，而NMDA受体只引起sustained型反应［6］，推测在onset，sustained 型神经元中AMPA受体分布较多，而在sustained型神经元中NMDA受体分布较多。
出生后GluR2/3在下丘的含量及分布部位均随年龄变化而变化，但GluR2/3怎样随年龄逐步变化，怎样由胞膜转移至胞内，它在各亚核团中及听觉通路其他核团又是怎样表达的？这些都有待于我们的进一步研究。
【参考文献】
1Tanaka H, Grooms SY, Bennett MV, et al. The AMPAR subunit GluR2: still front and center-stage. Brain Res, 2000, 886(1-2): 190-207.
2Schmid S, Guthmann A, Ruppersberg JP, et al. Expression of AMPA receptor subunit flip/flop splice variants in the rat auditory brainstem and inferior colliculus. J Comp Neurol, 2001, 430(2): 160-171.
3Niedzielski AS，Safieddine S，Wenthold RJ．Molecular analvsis of excitatory amino acid receptor expression in the cochlea．Audio1 Neurootol，1997，2(1-2)：79-91.
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